第六章 沉淀法.ppt

不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受蛋白质种类、温度、pH值和杂质等因素所影响，但大致上以丙酮为最佳，乙醇次之，甲醇更次。 其中乙醇是工业上最常用的沉淀剂。 沉淀过程中应控制好的参数 ① 温度 当乙醇与水混合时，会放出大量的稀释热，使溶液的温度显著升高，对不耐热的蛋白质影响较大。生产上常用搅拌、少量多次加入的办法，以避免温度骤然升高损失蛋白质活力。 另一方面，温度会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。 ② 乙醇浓度 通常随着乙醇浓度的上升，蛋白质溶解度下降。 ③ pH值 在确定了乙醇浓度以后，蛋白质的最低溶解度出现在蛋白质的等电点处，因此可以通过调节pH值来选择性分离蛋白质。 ④蛋白质浓度 应避免使用很稀的浓度，因为蛋白质在高浓度下才比较稳定。 有机溶剂沉淀法的优点 某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽，所得产品的纯度较高，从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂。 缺点： 需要耗用大量的溶剂，而溶剂的来源、贮存都比较困难或麻烦，并且沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性，收率也比盐析法低。 非离子型聚合物沉淀法 许多非离子聚合物如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和葡聚糖等都可用于沉淀蛋白质，其中最常用的是PEG。 相对分子质量从200到20000的不同聚合程度的PEG产品都是有效的，通常在蛋白质沉淀中使用PEG-6000或PEG-4000。 PEG沉淀作用的机理是基于体积不相容性，即PEG分子在溶剂中排斥蛋白质分子，优先水合的程度取决于PEG的分子大小和浓度，排斥体积与PEG分子大小有关，这些因素与被分离的蛋白质无关。 蛋白质在溶解度上的差别取决于蛋白质分子的相对大小和蛋白质-蛋白质分子间的相互作用，这种相互作用是因为PEG的空间排斥作用使蛋白质浓度增加而产生的。 PEG沉淀分离蛋白质的优点 ①体系的温度只需控制在室温条件下； ②沉淀的颗粒往往比较大，同其他方法相比，产物比较容易收集； ③PEG非但不会使蛋白质变性而且可以提高它的稳定性。 PEG沉淀分离蛋白质的缺点 PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去，为此需用超滤和液-液萃取来解决。 聚电解质沉淀法 聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物。可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。 聚电解质的沉淀作用与其分子大小、电荷密度以及蛋白质的净电荷有关。 蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成一个多分子络合物，当络合物超过游离蛋白质的溶解度极限值时，就发生沉淀。 影响沉淀过程的因素有溶液pH值、反离子的类型和浓度，以及聚电解质的量，若聚电解质过量，将导致蛋白质重新溶剂化。 金属离子沉淀法 金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。 例如锌易与组胺酸残基中的咪唑基结合，使蛋白质的等电点转移，从而降低蛋白质的溶解度。 金属离子沉淀蛋白质一般分为三类 第一类为能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子，如Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+； 第二类为能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，如Ca2+、Ba2+、Mg2+、pb2+； 第三类为与巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如Hg2+、Ag+、pb2+。 实际应用时，金属离子的浓度常为0.02mol/L。 复合物中金属离子的去除，可用离子交换法或EDTA金属螯合剂。 第六章 沉 淀 法 加入沉淀剂，改变溶剂和溶质的能量平衡，降低溶质的溶解度，使其离开溶液生成不溶性颗粒，沉降析出。 沉淀技术是一个广泛应用于生物产品（特别是蛋白质）下游加工过程的单元操作。它能够起到浓缩与分离的双重作用。 沉淀法的优点： 设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产，在产物浓度愈高的溶液中沉淀越有利，收率越高。 沉淀法的缺点： 所得沉淀物可能聚集有多种物质。 应用沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取，无论是实验室规模还是工业生产，沉淀法都得到了普遍应用。 沉淀法分离蛋白质的特点 ①使原料液体积减小10～50倍，简化生产工艺、降低生产费用； ②使中间产物保持在一个中性温和的环境； ③可及早将蛋白从其与蛋白酶混合的溶液中分离出来，避免降解，提高产物稳定性； ④用沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降到最低。 蛋白质的溶解特性 蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。 蛋白质的组成 一级结构 二级结构 高级结构 与蛋白质分子稳定化有关的力和相