3-12蛋白质的分离纯化和测定.pdf

蛋白质的分离纯化测定 介绍蛋白质分离纯化的步骤、主要方法、定量测定和纯度鉴定  为什么要进行蛋白质的分离纯化  研究目标蛋白质的结构、功能及生理学意义；  工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量 的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以 及糖浆等。  医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。  基因工程的需要  ………..  蛋白质分离纯化的基本流程 细胞 抽提 分离 纯化 鉴定 破碎 回收率/纯化倍数 回收率/纯化倍数 回收率/纯化倍数 纯度/活性/性质 总蛋白和目标蛋白含量监测 总蛋白含量与酶活力监测  分离纯化的要求和目的  纯度 ：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白 和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、 工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医 药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。  活性 ：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性  收率 ：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失， 而且提纯步骤越多，损失越大。  增加单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性  设法除去变性的和不要的蛋白质，目标蛋白质产量达到最高值。 1、细胞破碎  将蛋白质从原来的组织细胞中以溶解状态释放 出来，并保持原来的天然状态和生物活性  机械破碎法  渗透破碎法  交替冻融  超声波法  酶消化 2、抽提  将蛋白质从组织细胞液中提取出来  溶解性蛋白质：根据溶解性质采取相应的溶剂/ 缓冲液溶解出来  不溶性蛋白：将杂质溶解出来，剩余目标蛋白  膜蛋白质：脂蛋白、糖蛋白，选择溶剂  与细胞破碎操作步骤同步  避免蛋白质变性或失活 3、分离  将蛋白质从提取液中分离出来，缩小体积  处理量大，既能除杂质，又能浓缩  沉淀、吸附、超过滤、透析、冷冻干燥等方法  透析和超过滤原理  利用蛋白质分子不能透过 半透膜的性质 ，使蛋白质 与其它小分子物质如无机 盐、单糖、水等分开  常用的半透膜是玻璃纸、 火棉和其它合成材料  透析是将待提纯的蛋白质 溶液装在半透膜的透析袋 中放在蒸馏水中进行  透析外液可以更换 ，直到 透析袋里无机盐等小分子 物质降低到最小值为止。  透析和超过滤原理  利用压力和离心力 ，强行使其 它小分子和水通过半透膜 ，而 目标蛋白质留在膜上或一侧。  利用超过滤器可以进行分子量 段截留。 4、纯化  分离和纯化间无严格界限，  分离为粗分，方法简单，处理量大，除杂质浓缩  纯化为精准分离，处理量小，目标蛋白“挑选”  离子交换层析  凝胶过滤  疏水层析  亲和层析  高效液相层析  快速蛋白质液相层析  电泳法  结晶 蛋白质混合物分离纯化方法 性质 方法 规模 离心 大或小 大小和体积 凝胶过滤 一般小的 透析、超滤 一般小的 离子交换层析