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吉林省 大学生生物实验技能竞赛比赛科目指南 吉林省大学牛?牛物实验技能竞赛组织委员会 二O—二年五月 Hucker改良的革兰氏染色法鉴定微生物 一、 实验器材 1、 设备：显微镜（尼康YS100、YS2-H） 2、 材料：酒精灯、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、载玻片、盖 片、擦镜纸、白纸、革兰氏染色液（结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红液）、 生理盐水 3、 菌种：（1）大肠杆菌；（2）枯草芽泡杆菌 二、 实验步骤 1、 涂片 取一块洁净载玻片，在载玻片的左、中、右3处各滴加一小滴无菌生理盐 水，且均匀分布，用接种环以无菌操作分别从大肠杆菌和枯草芽泡杆菌斜面上 挑取少许菌苔于左、右一水滴中，从大肠杆菌斜面和枯草芽范杆菌斜面上各挑 取少许菌苔同置于中间一水滴中，分别混匀并涂成薄膜。 2、 干燥 室温白然干燥。 3、 固定 涂面朝上，通过火焰2?3次。 此操作目的是使细胞质凝眉I,以同定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片 上。 4、 初染 滴加结晶紫液，以刚好将菌膜覆盖为宜，染色l-2min,水洗。 5、 媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约lmim水洗。 6、 脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95% 乙醇脫色，直至流出的乙醇无紫色吋，立即水洗。 7、 复染 用番红液复染约2min,水洗。 8、 镜检 干燥后，用油镜观察，比较。 正确结果：菌体被染成深紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏 阴性菌。 三、要求 1、 竞赛选题内容应在2小时内完成； 2、 载玻片要洁净无油迹；要用活跃生长期的幼培养物做革兰氏染色；涂片 不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 3、 固定操作中，火焰不宜过热，以玻片不烫手为宜。 4、 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脫色是革兰氏染色操作的关键环节。脫 色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌；脱色时 间一般为20-30so 5、 在显微镜视野下观察出两种菌（大肠杆菌；枯草芽孑包杆菌）的形态，在 混菌中区分革兰氏阴性菌和阳性菌，并作图。 6、 写出实验报告，包括实验目的、原理、器材与材料、实验步骤、结果与 讨论。 胰蛋白酶比活力的测定 一、实验原理 胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，该酶对于由碱性氨基酸（如精氨酸，赖氨 酸）的竣基与其他氨基酸所形成的肽键具有高度专一性。本实验利用胰蛋白酶 能催化N?苯甲酰?L■精氨酸乙酯（BAEE）水解生成N?苯甲酰精氨酸（BA） 的原理，进行膜蛋白酶的活力测定。由于BAEE在253mn处的紫外吸收远低于 BA,而BAEE在胰蛋白酶的催化下逐渐生成BA,反应体系在253nm的紫外吸 收值随之增加，因此可以以/ A253nm来计算胰蛋白酶的酶活力。 胰蛋白酶的酶活力单位定义（底物BAEE）：在本实验条件下，以BAEE 为底物，每分钟使Z1 A253nm增加0.001所需的酶量定义为1个酶活力单位。 二、 实验器材 1、 设备:分光光度计（UVmini-1240）＞旋涡混合器（QL-901）、微量移液 器。 2、 材料：试管、试管架、石英比色皿、记号笔、枪头（1000微升、200微 升、10微升）、5mL移液管、吸耳球、擦镜纸、滤纸、洗瓶、烧杯。 3、 试剂：胰蛋白酶样品（浓度为mg/mL,体积为Xml,需用Tris-HCl缓 冲液（水）自行稀释指定倍数后测定（这里可以指定几个倍数，视实际酶活力 而定））、0.05mol/LpH7.8Tris?HCl 缓冲液、2mmol/LBAEEo 三、 实验步骤 1、取多支试管，分别标号为1、2、3、4…等，1号为空白组，其余为测定 组，按照表1顺序加入各相关试剂。 表1?胰蛋白酶活性测定加样程序 试剂/mL 空白组 测定组 0.05mol/L, pH 7.8 Tris-HCl 缓冲液 1.5 1.5 待测胰蛋白酶 0」 去离子水 0」 — 2mmol/L BAEE 1.5 1.5 总体积 3.1 3.1 2、以空白组校正A253nm值至0,测定组中加入底物液BAEE后，立即混合 均匀，用比色皿在UVmini?1240分光光度计上测定光吸收值A253nm，同时记录 时间。 3^每间隔lmin读取A253nm值一次，至6min终止读数。 4、通过调节酶的浓度，控制测定组测得ZA253?m/min在0.05010之间数据 视为有效。 5、计算每分钟平均A253nm增加值即ZA253nm/min。 /A253nm=【(A6min?A3min)/3 + (A5minA2min)/3 + (A4min-Aimin)/3 ] /3 四、要求 1、 竞赛选题内容应在2小时内完成； 2、 微量移液器在吸取液体时避免平置、倒置等状态，防止液体流入移液器 腔体内； 3、 微量移液器用后要调至最大量程放置；