基因操作及医学应用.pptVIP

分: 切: 限制性内切酶 “分子手术刀 ” 限制性核酸内切酶命名 Smith和Nathame命名原则（1973） 属名 + 种名 + 株名 + 流水号 举例： 流感噬血杆菌d株 （Haemophilus influengae d） Hind Ⅰ  Hind Ⅱ  Hind Ⅲ 5’AAGCTT 3’  Hind Ⅳ 3’TTCGAA 5’  限制性核酸内切酶 restriction endonuclease 在特异位点上切割DNA分子 分三类，常用为Ⅱ类酶 识别序列呈回文对称（palindrome sequence） 5’GAATTC 3’ 5’GGATCC 3’ 3’CTTAAG 5’ 3’CCTAGG 5’ EcoRⅠ的识别序列 5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’ HaeⅠ的识别序列 5’- GTTAAC-3’ 3’- CAATTG -5’ 限制性核酸内切酶酶切 单酶切 ? 用一种限制酶 酶切目的基因 和载体 ? 易发生自身连 接 双酶切 ? 用二种限制酶 酶切目的基因 和载体 ? 不易发生自身 连接 接: “分子针线” 目的基因片段与载体的连接 ★ 粘末端法：碱性磷酸酶退火 ★ 平接法：T4噬菌体DNA连接 ★ 接头法：人工合成R.E识别顺序 ★ 聚尾法：分别加连polyA(T)或G 是独立于许多细菌及某些真核细胞染色体外共价闭合环状的双链DNA分子，大小在1—200kb之间，能独立复制的最小遗传单位。 质粒（plasmid） 质粒的分类 克隆载体(cloning vector,Puc18,19)都有松弛的复制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。带有一些基本元件（ori,Ampr,Mcs等），用来克隆和扩增基因片段。 表达载体(Expression vector,PET30a,pMV361)除了有克隆载体的基本元件，还具有转录/翻译所必需的DNA顺序。为了有效的转录，必需有强大的启动子(Trp,Lac)。 重组DNA的转化与增殖 制备 Competence Cell（氯化钙处理幼嫩E.coli,yeast,动物cell,昆虫.) C．Cell--?R.DNA——”Hot shock”(42℃，2’) ——L．B．Culture--37℃，lhr． --LB．agar．plate -- genomic library． 转: 1. 阳性重组体的筛选 　　 抗药基因 　　　　　抗Ampicilin基因 　　　　 　Ampicilin敏感受体细胞 　　　　　　　　＋ 　　　　　　Ampicilin 培养基 　　　　　　　　↓ 　　　　　未转化菌落不能存活 筛: 2.颜色反应 　Lac+Polylinker+β-半乳糖苷酶 　　　Xgal 　　　　　蓝色/白色 利用 　3 影印原位杂交（Situ Hybridization) 　　　菌落ＤＮＡ 　　　　 　　　硝酸纤维滤膜 　　　阳性重组体 原位固定 重组探针杂交 4. 斑点杂交 ( Dot Blots ) 　　　　 已知重组DNA 　　　　　　滤膜 　　　重组DNA同源性和特异性 方阵打点 阳性重组DNA探针杂交 基因操作的基本策略 5. southern杂交 　　　 　DNA片段吸印 　　　　重组探针杂交 　　　　后处理 外源基因表达 克隆基因在原核细胞中表达 克隆基因在哺乳动物细胞中表达 克隆基因在其它表达系统中表达 昆虫表达系统 酵母表达系统 在原核表达体系（以Ecoli为代表）： 优点 1.遗传背景清楚,易于调控; 2.表达技术经典成熟,应用广泛,目前无以取代; 3.目的基因表达水平高, E.coli培养周期短，“物美价廉”. 缺点 1. 缺少真核蛋白质翻译后加工修饰系统,如剪切,糖基化,及正确二硫键形成等; 2. 表达蛋白质多以包涵体形式存在,需经复性才能恢复构象与活性； 3. 宿主本身杂蛋白质多,纯化步骤复杂,故某些蛋白质,特别时糖蛋白或脂蛋