泛素化蛋白质组.docx

一、叶片总蛋白的提取消化 1、取2 g叶片，在研钵中加入液氮充分研磨，然后转到离心管中，加入30 ml预冷的含有10% TCA和0.07% DTT的丙酮，充分混匀后在-20°C沉淀过夜。 2、4°C，35000 g离心1 h后，弃上清。加入30 ml预冷的含有0.07% DTT的丙酮，充分混匀后置于-20°C中1h。4°C，35000 g离心1 h，弃上清。 3、用30 ml预冷的含有0.07% DTT的丙酮洗涤沉淀2次，最后打开管盖风干，尽量使残留的丙酮挥发干净。 4、取适量裂解液(20Mm HEPES pH8.0，8M Urea，2.5mM 焦磷酸钠，1mMβ-甘油磷酸盐，50uM PR-169)溶解蛋白粉末。 5、25000 g，4°C离心30 min后，收集上清，即为蛋白，如上清含有杂质可再离心一次，定量测定蛋白含量后置于-80°C或进行下一步操作。本实验采用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质浓度，用BSA作为标准液，在96孔板中加入相应的BSA标准蛋白以及考马斯亮蓝试剂。 BSA浓度（ul） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 2.0 2.4 3.0 100 μg/ml标准蛋白(μl) 0.8 1.6 2.4 3.2 4 4.8 5.6 6.4 8.0 9.6 12 H2O(μl) 39.2 38.4 37.6 36.8 36.0 35.2 34.4 33.6 32.0 30.4 28.0 按顺序将上述标准蛋白加入96孔板，同时，将5μl待测蛋白液，95 μl的考马斯亮蓝试剂混匀后加入96孔板，三次重复，避光静置5-10 min后，置于分光光度计下测定在595 nm处的吸光度，取595 nm处吸光值与对应标准蛋白浓度制作标准曲线，并计算待测样品的浓度。 6. 加 1/278体积（36ul/10ml蛋白提取物）的 1.25M DTT 至蛋白上清液，混合均匀，置于55℃ 30min； 7. 冰浴使温度恢复至室温（不能太冰会沉淀）； 8. 加 1/10体积（1ml）碘乙酰胺溶液，混匀，室温避光 15min； 9. 用 20mM HEPES PH8.0 稀释蛋白液1:4倍（30ml/10ml蛋白提取物），至尿素终浓度至 2M； 10. 加 1/100 体积（100ul）的1mg/ml trypsin-TPCK，室温过夜（37℃培养箱14-18h）； 二、裂解肽段的纯化 1. 在样品中加1/20体积（2ml）的20% TFA至 终浓度为1%进行酸化，用pH试纸条测pH 3。冰浴15min，生成沉淀； 2. 室温5000g 离心 15min，取上清至新的50ml离心管； 3. 把10ml的注射器安装到Sep-Pak柱的短端，5ml 100% 乙腈预湿； 4. 用1ml，3ml，6ml Solvent A（0.1%TFA）依次过柱清洗； 5. 加入酸化的酶解产物（样品）； 6. 用1ml，3ml，6ml Solvent A（0.1%TFA）依次过柱清洗； 7. 再用2ml Solvent C（5%乙腈，0.1%TFA）过柱清洗； 6. 把柱子置于新的10 ml 塑料管上收集洗脱液。用3 x 2 ml of Solvent B (0.1% TFA, 40% 乙腈)依次洗脱肽段（用2ml管装洗脱液，每管1ml，易冻干）。 7. -80℃冷冻洗脱液2h（或过夜），置于真空干燥机，冻干以除尽 TFA。 （Note:在冻干前后消化的肽段都可以在-80℃保存数月，但加了IAP buffer以后就要继续做下去） 三、 免疫亲和纯化（IAP） 1. 冻干的肽段2000g（rcf），5min离心后（使粉末都在管底）加入 1.4ml预冷的1x IAP 缓冲液，用1ml的移液枪吸打重悬（避免气泡），用pH试纸测pH为中性（不低于6）后（若小于6，则用未调节pH的1MTris碱溶液滴定，5-10ul通常足以中和溶液），转移到2ml离心管中； 2. 10,000g，4℃，离心肽段5min，去掉不溶物，置于冰上； 3. 柱子先2000g离心30sec，去掉缓冲液，再用1mL 1X PBS清洗motif antibody-bead 4次，每次洗涤后2000g离心30sec，最后用40ul PBS重悬； 4. 加肽段到含motif antibody-bead的2ml离心管中，充分混匀，避免气泡； 5. 用parafilm密封离心管，4℃转动孵育2 h； 6. 2,000g，4℃，离心1min，保存上清（因为上清中含有未结合的肽段），用1ml移液枪转移上清至2ml管中，-80℃备用。 （Note:以下清洗过程都需在0-4℃进行） 7. 用 1ml预冷的 IAP buffer清