酚类和木质素.doc

3.1.3 酚类化合物含量测定 自由态和β-葡萄糖苷酶水解后酚类化合物含量的测定，参照Raskin等（1989）的方法并加以改进。取1 g冻样，用液氮研磨成粉末后加入3 mL 100 %甲醇，用超声波处理10 min，于4℃ 12000 g离心15 min。吸取上清液后，沉淀用3 mL 100 %甲醇溶解，再次离心，合并上清液。再于4℃ 1500 g离心10 min，从中吸取5 mL上清液在40℃进行旋转蒸干。干燥物用3 mL ddH2O在80℃溶解10 min。样品分为两份。取一份样品（1 mL）加入2.5 mL乙酸乙酯-环己烷（1：1）和50 μL HCl萃取（剧烈振荡），收集上层液体并用氮气吹干，干燥物溶于1mL 100 %甲醇中，用于自由态酚类化合物测定。取另一份样品（1 mL）加入1 mL almond β-glucosidase（3U/ mL），于37℃温育6 h，然后加入2.5mL乙酸乙酯-环己烷（1：1）和50 μL HCl萃取（剧烈振荡），收集上层液体并用氮气吹干，干燥物溶于1mL 100 %甲醇中，用于β-葡萄糖苷酶水解后酚类化合物测定。 高效液相色谱仪（Waters公司生产）检测参数：液相色谱柱用PinnacleⅡ C18柱（150×4.6 mm，5 μm），紫外检测器，检测波长320 nm，UV范围200- 400 nm，流速1 mL min-1，柱温30℃，样温25℃。检测程序（Bellés等，2008）：20 min线性坡度，由1 %乙酸（流动相A，溶于水）直到100 %甲醇（流动相B）。上样溶液先通过0.45 μm尼龙膜过滤。 木质素含量的测定参照Bruce和West（1989）的巯基乙酸法进行。取苗龄8周植株的花茎0.5 g，用液氮研磨成粉末，加入2 mL无水乙醇，于25℃ 12000 g离心30 min，去除大部分上清液后，室温干燥沉淀物12 h。然后，加入5 mL 2 N HCl和0.5 mL巯基乙酸（要用15ml圆底离心管），于95℃加热8 h（在二楼平台的通风厨里）后冰浴冷却，于4℃ 12000 g离心30 min。取沉淀加入2.5 mL dd H2O，再次4℃ 12000 g离心5 min。用5 mL 1 N NaOH悬浮沉淀物，置于25℃下18 h，其间轻轻搅动几次。25℃ 12000 g离心30 min后，取上清液（取多少？），加入1 mL HCl。4℃沉淀过夜后，于4℃ 12000 g离心30 min，取沉淀物，再加3 mL 1N NaOH溶解沉淀。用1 N NaOH作空白对照，测定OD280吸光值，即为相对木质素含量。