人脂联素真核表达质粒构建及其在LX-2中的表达.pdf

２００９年 ６月　　　　　 首 都 医 科 大 学 学 报 　　　Ｊｕｎ．２００９ 第３０卷　第３期　　　　 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｏｌ．３０　Ｎｏ．３ ［ｄｏｉ：１０．３７８５／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６７７９５．２００９．０３．０１５］ ·肝纤维化基础研究 · 人脂联素真核表达质粒构建及其在 ＬＸ２中的表达 张育先　白启轩　马　超　马　红 （首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心） 【摘要】　目的　构建人全长脂联素真核表达质粒，转染人肝星状细胞系（ＬＸ２），观察其表达及分泌情况，为脂联素在肝纤维化 作用的基础及临床研究提供实验数据。方法　提取人脂肪组织ｍＲＮＡ，用ＲＴＰＣＲ扩增出添加酶切位点的人全长脂联素基因片 段，双酶切扩增出的目的基因片段及空载体质粒Ｐ７，将酶切后的片段进行连接、转化构建质粒。用ＦｕＧＥＮＥＨＤ将构建成功的质 粒转染ＬＸ２细胞，用免疫荧光观察其转染效率及细胞定位，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测脂联素蛋白表达。结果　酶切及测序证实成功 构建人全长脂联素真核表达质粒，免疫荧光检测转染效率约为４０％，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测到３００００处存在目的蛋白表达，与预期 相对分子质量一致。结论　成功构建的人全长脂联素真核表达质粒能有效转染ＬＸ２细胞及表达脂联素蛋白。 【关键词】　脂联素；肝纤维化；人肝星状细胞系 【中图分类号】　Ｒ５７５ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｌａｓｍｉｄｏｆＨｕｍａｎＦｕｌｌｌｅｎｇｔｈ ＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎａｎｄＩｔｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＬＸ２Ｃｅｌｌｓ  ＺＨＡＮＧＹｕｘｉａｎ，ＢＡＩＱｉｘｕａｎ，ＭＡＣｈａｏ，ＭＡＨｏｎｇ （ ＬｉｖｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，ＢｅｉｊｉｎｇＦｒｉｅｎｄｓｈｉｐＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） 【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄ，ａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｉｔｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅ（ＬＸ２）ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＨｕｍａｎａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｍＲＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｔｈｅｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴＰＣＲ）．Ｂｏｔｈａｍｐｌｉｆｉｅｄｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔａｎｄｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒｐｌａｓｍｉｄＰ７ｗｅｒｅｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｅｄ，ｔｈｅｎｔｈｅｄｉｇｅｓｔｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｌｉｇａｔｅｄａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｔｏＬＸ２ｃｅｌｌｓｂｙＦｕＧＥＮＥＨＤｒｅａｇｅｎｔｓ．Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｗａｓｅｘｐｌｏｒｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｆｒｏｍｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄＰ７ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｐｌａｓｍｉｄｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｏｔｈａｔｐｕｂｌｉｓｈｅｄｉｎＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｗａｓａｂｏｕｔ４０％，Ａ３００００ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗｈｉｃｈｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｅｘｐｅｃｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｈｕｍａｎｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ