用于质谱鉴定的蛋白质凝胶样品酶解方法.docVIP

SDS蛋白条带酶解方法 1、用手术刀片切下胶上目标条带(或用自制切点器切下感兴趣的点)，置于EP管中（胶块切成约1 mm3大小），同时切下空的胶块作对照。 2、加入200-400 μL 100 mmol/L NH4HCO3/30%ACN脱色，清洗至透明，去除上清，冻干注：脱色液体积过量为好，脱色至透明，不必担心蛋白质的损失，因为完整蛋白质在此条件下很难被洗脱。 3、每管加入90 μL 100 mmol/L NH4HCO3，10 μL 100 mmol/L DTT，56 ℃孵化30分钟，还原蛋白质。 4、去上清，每管加100 μL 100%ACN，5分钟后吸去。 5、每管加入70 μL 100 mmol/L NH4HCO3，30 μL 200 mmol/L IAA（现配，避光保存），暗处20分钟。 6、去上清，每管加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3，室温15分钟。 7、去上清，加入100 μL 100%ACN，5分钟后吸去，冻干。 8、冻干后，各加入5 μL 2.5-10 ng/μL Trypsin溶液，置于4 ℃冰箱30-60分钟，使胶块充分吸胀（若仍有剩余液，吸出打掉）。 注：50 ng酶量基于考染一块胶1000 μg的上样量，12.5 ng基于银染一块胶100 μg的上样量。上样量增加，酶量同比增加，酶与被分析蛋白质质量比一般为1:20-1:100。 9、