油菜基因的克隆.ppt

本实验是在前期分子标记定位基因的基础上对引起相关表型变异的基因进行分子生物学研究，以明确引起表型变异的原因，为提高油菜产量做出贡献。 突变体油菜叶、茎、花、蕾 提取叶片DNA 依据已测序生物中的同源基因设计3条引物 PCR扩增 PCR产物克隆进pMD19-T载体，然后测序 序列拼接，得到几种候选序列，并进行翻译 BLAST比对搜索同源基因，把翻译出来的蛋白质序列进行Clustal比对 分析比对结果，初步判断基因序列的变异，特别是保守区域的变异 提取RNA，反转录 依据得到的DNA序列设计引物 RT-PCR PCR产物克隆进pMD19-T载体，然后测序 序列拼接，得到几种候选序列，并进行翻译 BLAST比对搜索同源基因，把翻译出来的蛋白质序列进行Clustal比对 分析比对结果，确定基因序列的变异，特别是保守区域 功能域预测，亚细胞定位 取同一生长时期的油菜叶、茎、花、蕾，迅速在液氮下冷冻，然后放于-80 ℃下待用 提取RNA，反转录 设计特异性引物 RT-PCR 分析表达情况 设计引物 PCR扩增得到包括启动子、ORF、3’端保守序列在内的全长基因序列 双酶切连接进入双元载体，筛选，通过农杆菌介导的浸染花芽的方法转入拟南芥以及野生型油菜培养 观察表型变化情况 通过构建干扰载体，进行转基因研究，抑制基因表达，观察突变体表型