第4章 代谢控制发酵育种的基本技术.pptVIP

第四章 代谢控制发酵育种的基本技术 要控制微生物的代谢作用，就是要控制培养条件和微生物的遗传型。改变微生物的遗传型往往是控制代谢的最有效途径。 方法包括培育有遗传标记的突变株，或将目的产物基因进行克隆而加以扩增。 要获得有目的遗传标记的突变株，常采用诱变或细胞内基因重组等育种技术。 一、诱变剂 突变：生物出现与亲代不同的遗传性状的现象，即生物体的表型发生了可遗传的变化，其本质是生物体的遗传物质（DNA或RNA）中的核苷酸序列发生了稳定、可遗传的变化。 凡是能够显著地提高突变频率的理化因素均可称为诱变剂。 常用的诱变剂可分为物理诱变剂和化学诱变剂。 化学诱变剂 在选择有效化学诱变剂的工作中，已经试验过几千种化学物质，发现从简单的无机物到复杂的有机物都有许多具有诱变作用的物质，如金属离子、一般化学试剂、生物碱、代谢拮抗物、生长激素、抗菌素、高分子化合物、药剂、农药、灭菌剂、染料等。 化学诱变剂都具有毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，避免与皮肤直接接触，也要防止污染环境。 大多数情况下，化学诱变比电离辐射诱变更有效，更经济。 1、紫外线 紫外线是一种使用方便且诱变效果较好的物理诱变剂。紫外线的波长为136～390nm，其中波长为260nm的紫外线杀菌能力最强。人工制作的紫外灯发出的253.7nm的紫外线杀菌能力强而且稳定，诱变效果良好。 胸腺嘧啶二聚体的形成是紫外线改变DNA分子结构及生物活性的主要途径。 紫外线对生物体具有杀菌和诱变双重生物学效应。 紫外诱变操作：比较简单，在诱变箱内，边进行紫外照射边搅拌细胞悬液即可。 注意事项： 由于UV的穿透力不强，要求菌液不要太深，约0.5cm~1.0cm厚； 为了避免光复活作用，照射过程及照射后操作必须在暗处或红光下进行； 紫外诱变不受温度影响，可在室温下进行； 最好安装稳压电源器； 操作时注意防护（皮肤、角膜）。 2、亚硝酸 亚硝酸能使碱基氧化脱氨，结果使A→H，C→U，G→X，从而改变了碱基的配对关系，引起突变。 G脱氨后成为X，X是一种无意义的碱基，不能同任何一种其它碱基配对。因此，这种变化只能导致细胞死亡，而不能期望它会诱发突变。 亚硝酸极不稳定，易分解，易挥发。因此，需要在临用前将NaNO2在pH4.5醋酸缓冲溶液中生成HNO2。诱变后，应用大量水稀释终止亚硝酸作用。 生物学上的烷化剂是指在正常的生理条件下，能将其烷基转移给重要生物大分子的一类化合物。 烷化剂能够与DNA分子的许多部位发生作用，结果使DNA分子增加了烷基侧链，从而改变了DNA的分子结构，这就是烷化剂引起生物体发生突变的主要原因。 在烷化剂中最常用的是硫酸二乙酯（DES）和亚硝基胍（NTG）。 二、诱变育种 诱变育种工作量大，周期长，对一般周期为7-10d的抗生素菌种来说，一代诱变需要2-3个月。 具体要选育怎样的菌种，在诱变育种前，应该对生产的设备和工艺有相当的知识和全面了解。如现有菌种的生产能力，菌种适应情况，现有生产设备结构等，新菌种能否达到缩短周期，发酵低热，降低成本等等。 诱变育种的主要环节是： ⑴以合适的诱变剂处理大量分散的微生物细胞悬浮液（细胞或孢子），在引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的变异频率大大提高。 ⑵设计一种有效的筛选方法淘汰负变株，并把正突变株中少数变异幅度最大的具有优良性状的菌株巧妙地挑选出来。 1、出发菌株的选择 工业上用来诱发变异的菌株，称为出发菌株。 出发菌株通常有三种： ①从自然界分离得到的野生型菌株：对诱变剂敏感，易发生变异，容易产生正突变。 ②由自发突变经筛选得到的菌株：也属于野生型菌株，在生产中使用的，具有一定生产能力，容易收到较好的效果。 ③已经诱变过的菌株：较为复杂，常用回复突变或经基因重组后再作为诱变育种的出发菌株。 大幅度提高产量是经过多次诱变、筛选的结果。 从自然环境中分离目的微生物 以采集土壤为例，一般田园土和耕作过的土壤，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内； 采集范围也可以是植物、腐败物品、水域等。 2、菌龄 一般处理细菌的营养细胞，采用生长最旺盛的对数期，孢子或菌株要年轻、健壮，其变异率较高且重现性好。 霉菌和放线菌一般处理它们的孢子。处理时力求孢子处于活跃状态，即最好采用刚刚成熟时的孢子，其变异率高。如在处理前事先将孢子培养数小时，使其脱离静止状态，则诱变率也会增加。 3、菌悬液的制备 一般采用生理状态一致（用选择法或诱导法使微生物同步生长）的单细胞或孢子进行处理。 处理前细胞尽可能达到同步生长状态，细胞悬浮液经玻璃珠振荡打散，并用脱脂棉或滤纸过滤，以达到单细胞状态。对于酵母等个体较大的细胞，可换用二层擦镜纸过滤，经此处理，分散度可达90