转基因动物技术 课件教学案例.pptVIP

Transgenic Technology;Definition Transgenic technology refers to the genetic engineering of an organism so that its genomic DNA is altered to over- or underexpress certain genes. ;Transgenic technique Gene Knock Out Gene Knock In Gene Knock Down Gene Trapping mouse, rabbit, rat, sheep, pig, caw etc.;The 2007 Nobel Prize in physiology or medicine is awarded for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells. ; Mario Capecchi and Oliver Smithies, independently of each other, discovered how homologous recombination between segments of DNA molecules can be used to target genes in the mammalian genome and developed methods to generate genetically modified mice. ; 转基因小鼠构建过程;北京诺兰信科技 北京高校生物技术转化平台;/;;定点突变技术;;分子开关--Cre/Loxp 系统;Cre-LoxP系统的特性;两个loxp位点的方向相反;Knock-out gene Knock-out stop cassette Knock-out label;FLP/frt重组系统;时间控制和组织特异性表达;LSL-Cre : loxp-stop-loxp, Cre FSF-Flpo: FRT-stop-FRT, Flpo Established Lung Tumors;;HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶，自杀基因 HSV－tk基因的产物使细胞能利用培养基中的GANC (Gancyclovir，丙氧鸟苷）而死亡 例如将在肝癌细胞中可表达AF基因的调控区与水痘一带状疮疹病毒中的胸苷激酶（VZV-TK）基因进行重组，构建逆转录病毒载体导入体内，TK基因只在肝癌细胞中表达，产生的TK可催化6-甲基嘌呤阿拉伯糖核苷磷酸化产生araAMP，进一步磷酸化形成细胞毒物质araATP，杀死肝癌细胞。;Neo基因 卡那霉素抗性基因编码的是新霉素磷酸转移酶II，基因记做neo，能通过降解G418、新霉素和卡那霉素来实现真核和原核细胞的相应抗性。 一般应用于原核生物就是卡那霉素抗性基因,应用于真核生物就是G418抗性。 ; 外源基因导入ES细胞的方法有: 1.电穿孔法 2.逆转录病毒载体法 3.脂质体包装法 4.磷酸钙沉淀法 ;三、囊胚注射和杂交筛选;小鼠基因型的鉴定？;;129和C57BL/6纯系小鼠 近交系Inbred Mice;;表1.用基因打靶法制备的一系列重要的基因敲除小鼠及表型： 敲除基因 表现型 RAG-1和/或RAG-2 因无TcR基因重排而无T细胞 TcRβ 双阴???胸腺细胞聚集，双阳性胸腺细胞很少，TcRα正常重排 TcRα 有双阴和双阳T细胞而无单阳性T细胞 P56lck T细胞发育在早期双阳性成熟期受阻，无?δT细胞 CD3-ζ T细胞发育在早期双阳性成熟期受阻 CD45 T细胞发育在双阳性成熟期受阻 MHC-Ⅱ,不变链 无CD4+T细胞，CD4+CD8-/+很少，正常NK，1.1+CD4+,CD8+正常 CD4 CD8+数量和功能正常 MHC-Ⅰ，β－2微球蛋白 无CD8+ T细胞，CD4+