酵母菌的基因工程讲义教材.pptVIP

5.2 酵母菌的基因工程 发展历程 1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。 1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。 1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。 我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。 1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。 酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统 优势在于： 安全无毒，不致病； 有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率； 培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。 缺陷在于： 表达效率相对低 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工修正。 5.2 .1 酵母菌的宿主系统 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变 突变 产生的异源蛋白 增加产量（倍数） 作用位点 SSC1 凝乳酶原 Ca2+-ATPase 牛生长因子 3-10 转录后 SSC2 凝乳酶原 转录后 牛生长因子 rgrl 鼠α—淀粉酶 5-10 转录后 osel β—内啡肽 7-12 转录后 NDS 人血清蛋白 溶酶原活化剂抑制因子2型 10 转录 ss1l α1 —抗胰蛋白酶P 人溶菌酶 10 羧肽酶Y rho 人溶菌酶 10 转录 人表皮因子 NDE 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。 突变类型 生物效应 mnn 甘露糖生物合成缺陷型 alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 och 外侧糖链添加缺陷型 酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用 靶蛋白 靶蛋白 靶蛋白 Lys Lys Ubiquitin 76 aa Lys Lys Ubiquitin ligase E3 Ubiquitin ligase E3 蛋白酶体 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UBI4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。 UBA1缺陷型： UBA1编码泛素