实验4 醋酸纤维薄膜法分离血清蛋白质.pptVIP

实验4 醋酸纤维薄膜法分离血清蛋白质 一 、实验目的 二、实验原理 利用带电粒子在电场中移动速度不同而分离的技术称为电泳技术。 醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术，醋酸纤维（即二乙酸纤维素）薄膜具有均一的泡沫状结构（厚约120μm），渗透性强，对分子移动无阻力，故可用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用等优点。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 将血清样品点样于醋酸纤维膜上，在pH 8.6的缓冲液中电泳，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，分子大小和形状各异，氨基酸组分、立体构象和相对分子量不同，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。电泳后，CAM经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白5条区带。 在一定的范围内，蛋白质的含量与结合的染料量呈正比，故可将各蛋白质区带剪下，分别用0.4 mol/LNaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。 三、实验试剂和材料 血清：抗A血清（医用） 巴比妥-巴比妥钠缓冲溶液（pH8.6） 染色液：1％氨基黑10B染料 漂洗液 浸出液 透明液 醋酸纤维薄膜：2×8 cm，厚度120μm 用普通的薄载玻片自制点样器 直流稳压电泳仪，水平电泳槽 Ⅰ.准备和点样： 在浸泡薄膜前应辩清薄膜的正反面，因为浸泡打湿后不易辩别正反面。 在距膜一端1.5cm用铅笔作好标记，将薄膜漂在缓冲液液面上，迅速湿润，整条薄膜一致而无白点。然后用竹镊子将薄膜轻轻完全浸入缓冲液中，待膜完全浸透后使用(约0.5h)。 然后将薄膜制作电桥：将电泳缓冲液倒入电泳槽两边，平衡两边液面。根据电泳槽的纵向尺寸，剪裁尺寸合适的滤纸条,附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电泳槽的缓冲液内。然后，用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法，在另一个电极槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。它们的作用是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的中间“桥梁”。 用竹镊子取出充分浸透(膜上没有白色斑痕)的薄膜，夹在两层粗滤纸内，吸去多余的缓冲液，然后平铺 (无光泽面朝上). 用注射器吸取少量血清滴在一干净玻片上，用自制的点样器的截面蘸一下血清液滴，再将样品“印”在薄膜无光泽面的点样区(距薄膜一端1.5cm处)。使血清均匀分布在点样区，完全渗透于膜内,形成具有一定宽度、粗细匀称的直线。 事先可在滤纸上练习点样，掌握点样技术，这是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。 将点好样的薄膜 (无光泽面朝下)两端紧贴在支架的滤纸桥上(加血清端靠负极)，中部悬空平直。加上槽盖平衡10min，仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后通电。 Ⅱ.电泳条件 电压90-110V，电流0.4-0.6mA/cm2，通电时间45-60min。泳动距离约达3.5-4.0cm时即可断电。 Ⅲ.染色 电泳完毕，将醋酸纤维薄膜浸于1％氨基黑10B染料中染色5-10min，然后取出，投入漂洗皿中用漂洗液反复漂洗至背景无色（约4-5次） 。 Ⅳ.处理及保存 染色，洗脱后，浸于蒸馏水中约5-10min，用滤纸吸干，然后夹于书本中即可作短期保存。 五、实验结果与讨论 对电泳区带结果进行分析讨论。 1、据人血清中各蛋白质的性质，如何估计它们在pH8.6巴比妥电泳缓冲液中的相对迁移速度? 2、简述醋酸纤维薄膜电泳的优点。 * * * * 掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。 表 血清中各蛋白组分的等电点和相对分子量 清 薄膜的准备 电泳槽的准备 点样 电泳 染色与漂洗脱色 四、实验操作流程 一般经漂洗后，薄膜上可呈现清晰的 5条区带，由正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白。 *