BrdU标记及染色实验方案.PDFVIP

此为临时链接，仅用于预览，将在短期内失效。 BrdU标记及染色实验方案 abcam 2016-04-29 溴脱氧尿苷（5-溴-2-脱氧尿苷，BrdU）是用于鉴别增殖细胞的胸腺核苷的合成类似 物。BrdU 标记既可以在体外进行，用以标记细胞系和原代细胞培养物，也可以在体 内进行，用以标记活体动物的细胞。BrdU可融入重组 DNA，并且能用抗 BrdU 抗体 检测出来。 进行 BrdU 标记之后，还需在固定和通透化之后进行 DNA 水解步骤（有时称为 DNA 变性步骤），让抗 BrdU 抗体与 DNA 中的 BrdU 结合。 用 BrdU 进行体外细胞标记 1. 将3 mg BrdU 溶于 1 mL 水，制备 10 mM 的 BrdU (ab142567) 母液。 2. 在细胞培养基中稀释10 mM BrdU 母液，制取 10 µM BrdU 标记溶液。 3. 在无菌条件下，用0.2 µm 的滤器过滤 10 µM BrdU 标记溶液。 4. 弃去现有培养基，重新加入10 µM 标记溶液。 5. 用 CO 孵育器在 37℃ 下将细胞在 BrdU 标记溶液中孵育 1–24 小时。 2 注意：可根据细胞分裂速度调整 BrdU 孵育时间。原代细胞可能需要长达 24 小时的时间，而高速分化的 增殖细胞系可能仅需一小时即可。应当优化达到最佳信噪比所需的确切时间。 6. 弃去 BrdU 标记溶液，并用PBS 洗涤细胞两次，每次约 5 秒。 7. 之后再用 PBS 洗涤三次，每次两分钟。 8. 根据标准免疫细胞化学(ICC) 实验方案对细胞进行固定和通透化。但是，在进行 免疫染色之前，应先参考下方内容进行 DNA 水解步骤。 用 BrdU 进行体内标记 目前已有多种使用 BrdU 进行体内细胞标记的方法。其中两种常用的方法为腹腔 内注射和口服。 腹腔内注射 1. 用 PBS 稀释BrdU，制备 10 mg/mL 无菌溶液。 2. 根据常规，以100 mg/kg 的浓度为小鼠注射 BrdU。 3. 用 BrdU 处理后，可根据经批准的实验室程序处死实验动物。 此为临时链接，仅用于预览，将在短期内失效。 4. 根据标准免疫组织化学 (IHC) 实验方案对组织进行固定和处理。但是，在继 续进行免疫染色之前，应先参考下方内容进行DNA 水解步骤。 注意：在快速分裂的组织中，在注射后30 分钟即可检出 BrdU 的渗入。然而，在绝大部分组织中，可能需要等待 长达 24 小时。具体的处理时间和剂量可根据目标组织进行调整优化。 口服 尽管因为缺乏动物饮水量方面的对照，容易造成实验误差，但由于 BrdU的口服 是一种非侵入性方法，因而适用于 BrdU 的长期施用。 1. 用饮用水将BrdU稀释至 0.8 mg/mL。每天制备新鲜溶液，并进行更换。 2. 用 BrdU 处理后，可根据标准实验方案处死实验动物。 3. 根据标准 IHC 实验方案对组织进行固定和处理。但是，在进行免疫染色之 前，应先参考下方内容进行DNA 水解步骤。 注意：对小鼠进行实验时，BrdU剂量应为每天 225 mg/kg（根据每只小鼠的饮水量计算得出），才可有效进行 BrdU 标记。然而，具体剂量应根据实验条件进行调整优化。 DNA 水解 准备 硼酸钠缓冲液：3.8 g 硼酸钠（分子量=381.4）+ 100 ml 蒸馏水。用 NaOH 调 节 pH。 细胞 1. 室温下用1–2.5 M HCl 孵育细胞 10 分钟到 1 小时。具体的 HCl 浓度和孵 育时间应根据实验条件调整优化。如果孵育时间较短，则采用 37℃ 的孵育 温度可能比室温更为有效。 2. 可选步骤：弃去HCl 并用 pH 8.5、0.1 M 的硼酸钠缓冲液在室温下中和 30 分钟。 3. 用 PBS 洗涤三次。 4. 根据标准免疫细胞化学(ICC) 实验方案，继续进行免疫染色。 组织切片 注意：如果使用石蜡包埋的切片，应在操作前进行脱蜡。 1. 用 1-2 M HCl 孵育切片 30 分钟到 1 小时。具体的 HCl 浓度和孵育时间应 此为临时链接，仅用于预览，将在短期内失效。 根据实验条件调整优化。如果孵育时间较短，则采用 37℃ 的孵