食品分子生物技术.ppt

2.食品生物技术：利用生物体及其细胞、亚细胞和分子组成部分，结合工程学、信息学等手段去研究及加工处理或制造食品产品的新技术。 是生物技术在食品工业中的应用，贯穿于食品制造的全过程（包括上游过程和下游过程）。 不完全是新兴学科，也包括传统的生物技术，如制酱等。 二、目的基因的制备 单链酶法 碱基GC配对之间有三个氢键，比AT配对的稳定性高。 当用加热或其它变性试剂处理DNA时，双链上 AT 配 对较多的部位先变成单链，应用单链特异的S1核酸酶 切除单链，再经氯化銫超速离心，获得无单链切口的 DNA。 分子杂交法 单链DNA与其互补的序列总有“配对成双”的倾向，如 DNA︰DNA配对或DNA︰RNA 配对，这就是分子杂 交的原理。 二、目的基因的制备 （二）化学合成法 根据蛋白质肽链的氨基酸顺序推知遗传密码，用化学 方法人工合成基因。 较短的基因（60-80bp）。 用途：PCR引物 测序引物 定点突变 核酸杂交探针 DNA合成仪 二、目的基因的制备 （三）鸟枪法：基因文库 1、基因组文库 2、cDNA文库 二、目的基因的制备 1、基因组文库 一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后， 将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了 基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生 物体的整个基因组，将这些载体导入到受体细菌或细 胞中，这样每个细胞就包含了一个基因组DNA片段与 载体重组DNA分子，经过繁殖扩增，许多细胞一起包 含了该生物全部基因组序列，这一个集合体叫做基因 文库。 目前的载体可用λ噬菌体、柯斯质粒（cosmid）、 各种人工染色体。 二、目的基因的制备 基因组文库有着非常广泛的用途： 分析、分离特定的基因片段； 用于基因表达调控研究； 用于人类及动、植物基因组工程的研究等等。 但要注意的是，从基因组DNA文库所分离得到的基因序列包含有内含子序列，因此不能直接在原核细胞中进行表达。 下图给出了一个以λ噬菌体DNA为载体，组建真核基因组DNA文库的策略。 二、目的基因的制备 基因组D N A文库 基因组DNA 限制性内切酶 基因重组 体外包装 转化细胞 提取DNA 筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法） 二、目的基因的制备 检测重组体克隆的菌落杂交技术 生长着转化菌落的平板 硝酸纤维素滤膜 置于溶菌液中的滤膜 溶菌 碱变性 酸中和 洗去细胞碎片 烤干 杂交 放射自显影 具DNA印迹的滤膜 显示阳性菌落斑点的X光底片 挑取阳性菌落 保留 原盘 平板 二、目的基因的制备 特点及应用： 包含所有遗传信息； 构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）； 筛选难度大； 用于研究基因在基因组中的情况。 二、目的基因的制备 2、cDNA文库 启动基因 结构基因 增强子 启动子 TATA框 外显子 外显子 外显子 内含子 内含子 真核基因的结构及调控序列示意图 首先根据转基因表达的部位或特异性选取一定的植 物组织，从中提取 RNA制备 polyA RNA(含多聚腺 苷酸的核糖核酸)，经体外翻译确证 mRNA 的活性 后，经逆转录酶作用合成第一链 cDNA，再以此模 板进行复制得到双链 DNA ，最后加上限制内切酶 的接头并克隆到载体上，如细菌质粒、噬菌体和 Cosmid，酵母的人工染色体等等。 二、目的基因的制备 从真核生物的组织或细胞中提取mRNA，通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链，将双链cDNA和载体连接，然后转化扩增，即可获得cDNA文库。 cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链，聚合酶合成cDNA第二链，加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。 一、工具酶 （5）酶反应的最适温度： 大多数限制酶反应的最适温度为37℃， 少数限制酶的反应温度高于或低于此温度。 （6）酶解反应的操作步骤及注意要点。 一、工具酶 7、限制性内切酶的主要用途 （1）在特异性位点上切割DNA，产生特异的限制性 内切酶切割的DNA片段。 （2）建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱。 （3）构建基因文库。 （4）用限制性内切酶切除相同的粘性末端，以便重 组DNA。 一、工具酶 应用 2、酶切图谱的构建 一、工具酶 M.RE CH3 CH3 CH3 RE RE RE RE RE RE RE RE RE RE RE 3、用于基因组文库的建立 一、工具酶 3、用于cDNA的连接 CH3 CH3 CH3 与载体相连 甲基化酶 人工接头 RE RE RE RE 一、工具酶 在基因工程中，最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有: 大肠杆菌DNA聚合酶I