碱性磷酸酶米氏常数的测定.docVIP

碱性磷酸酶米氏常数的测定 【实验目的】通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）米氏常数的测定，了解其测定方法和意义。学会运用标准曲线测定酶的活性及观察抑制剂对酶促反应动力学的影响，加深对酶促反应动力学的理解。 【实验原理】本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。 酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光值的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小。 【实验步骤】1. 底物浓度对酶促反应速度的影响 取6支试管，作好标记。按下表操作：（未加抑制剂组） 试剂/ml 管号 1 2 3 4 5 6 0.01 mol/L底物液 0.10 0.20 0.30 0.40 0.80 0.0 pH10.0, 0.1 mol/L碳酸盐缓冲液 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 蒸馏水 1.10 1.00 0.90 0.80 0.40 1.20 37℃水浴中保温5分钟 AKP酶液 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 最终底物浓度(mmol/L) 0.5 1.0 1.5 2.0 4.0 0.0 另取6支试管，做好标记。按下表操作：（高精氨酸组） 试剂/ml 管号 1 2 3 4 5 6 0.01mol/L底物液 0.10 0.20 0.30 0.40 0.80 0.0 5mmol/L高精氨酸溶液 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 pH10.0,0.1 mol/碳酸盐缓冲液 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 蒸馏水 1.05 0.95 0.85 0.75 0.35 1.15 37℃水浴中保温5分钟 AKP酶液 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 最终底物浓度(mmol/L) 0.5 1.0 1.5 2.0 4.0 0.0 (2) 加入酶液(0.05μg/ml)后,各管混匀并立即记录时间,将上述各管置37℃水浴中准确保温15分钟。 (3) 保温结束，立即加碱性溶液1.1 ml终止反应。 (4) 各管分别加入0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml，0.5%铁氰化钾2.0 ml，充分混匀，放置10分钟，以6号空白管作对照，于510 nm波长处比色，根据酚标准曲线计算酶活性。 (5) 以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐标，以各管吸光度值的倒数或者以酶活性单位的倒数为1/V做横坐标，作图求出Km值。 2.酚标准曲线的绘制 (1) 取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂： (2) 混匀后室温放置15分钟，于510 nm波长处比色。 (3) 以酚含量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制酚标准曲线。 试剂/ml 管号 1 2 3 4 5 6 0.1 mg/ml酚标准溶液 0.0 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 蒸馏水 2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60 37℃水浴保温5分钟 碱性溶液 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 0.3%4-氨基安替比林 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5%铁氰化钾 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 【实验结果与分析】 1.未加抑制剂组 底物浓度S (mmol/L) 0.500 1.000 1.500 2.000 4.000 浓度倒数1/S 2.000 1.000 0.667 0.500 0.250 吸光度V 0.129 0.246 0.288 0.387 0.752 吸光度倒数1/V 7.752 4.065 3.472 2.584 1.330 得到拟合直线方程：y=3.5275x+0.7246 根据1V Vmax=1/0.7246=1.382 Km=V 2.高精氨酸组 底物浓度S (mmol/L) 0.500 1.000 1.500 2.000 4.000 浓度倒数1/S 2.000 1.000 0.667 0.500 0.250 吸光度V 0.130 0.259 0.303 0.446 0.624 吸光度倒数1/V 7.692 3.861 3.300 2.242 1.603 得到拟合直线方程：y = 3.4764x + 0.6688 根据1V Vmax=1/0.6688=1.495 Km=Vmax 3.酚标准曲线 分析：由上述图表来看，在加入高精氨酸抑制酶活性后，酶的Km值增大，Vm值也增大 【实验讨论】 在实验过程中，滴加试剂和反应时间的控制一定要