浅谈高通量检验检测技术及问题.docVIP

植物检疫学课程论文 题目：浅谈高通量检验检测技术及问题 学院：农学院 专业：植物保护 班级：091 学号：0931100532 姓名：梁琨 指导老师：彭好文 屈达才 浅谈高通量检验检测技术及问题 摘要：本文着重介绍了高通量检验检测技术的原理，应用及其存在的问题，对植物病毒检测技术中几种常用的高通量检测方法进行综述，主要对酶联免疫吸附法、多重PCR及生物芯片检测技术的原理、特点进行了分析并指出各类高通量检验检测技术所存在的问题以及现有的解决方法，为植物的检验检测提供了理论基础。 关键词：高通量 多重PCR 存在问题 前言 近年来，植物病毒在世界各国的危害日趋严重，所发现和报道的病毒种类日益增多，目前植物病毒分为18个科，共有近1 000种病毒，其中包括约280个暂定种。加入WTO以后，随着我国的对外开放及国际贸易不断扩大，境外植物病毒通过口岸进入境内的风险逐渐加大，我国出入境检验检疫部门面临着空前的挑战。但由于各种原因，目前植物病毒在口岸被检验检疫机关截获的机率依然不高，远远低于昆虫和真菌检出率。目前，国内针对植物病毒的检疫方法主要包括鉴别寄主反应(生物学方法)、电镜观察、血清学试验、和分子生物学手段。聚合酶链式反应(PCR)技术是一种在体外快速扩增特定DNA序列的方法。PCR及其相关技术以其快速、灵敏和准确等优点已广泛应用于植物病害的检测研究。多种PCR方法被应用到植物病毒的检测中，但同样存在着假阳性或假阴性问题，且这些检测技术通常每次只能检测一种病毒，无法满足快速通关要求。因此，在口岸植物检疫方面，高通量是目前植物病毒检测的发展方向。 高通量检测技术 高通量检测技术是指一次可检测多个样品或对同一样品进行多种检测的技术。高通量检测技术就包括酶联免疫吸附测定技术，多重PCR技术，基因芯片检测技术等。他们都是可以一次检测多个样品或对同一样品进行多种检测的技术。 多重PCR技术 多重PCR是在PCR基础上发展起来的一种可以同时检测两个或两个以上日的基因片段的PCR方法，主要原理是设计两对或两对以上引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样品中几个不同DNA目的片段。该方法既有单个PCR的特异性和敏感性，还能提供内部对照，指示模板数量和质量。与常规方法相比，多重PCR反应方法相同，但在反应中加入的是多对引物，而不是一对引物。多重PCR技术在植物检疫方面的目标是，能够直接检测同时受多种病毒侵染的植物，以达到快速检测的要求。在确立多重PCR实验方案时，要特别重视优化体系中的主要成分和反应条件。当确立了一个成熟的反应后，要视不同的模板和引物对实验条件加以调整，以保证结果的特异性和可靠性。多重PCR具有单个PCR无法比拟的优越性，消耗时问和试剂少，减轻了工作量，一次反应可以同时检测多个基因，同时还可以提供内部参照，有效防止假阴性或假阳性对结果的干扰。 目前，尽管已在植物病毒检疫领域建立了多重PCR的检测方法，但是多重PCR方法本身还存在一些普遍的问题： ①特异性和灵敏度低； ②某一特定片段的优先扩增； ③容易引起引物二聚体； ④重复性不好。 这些问题需要在不断优化反应条件中逐步解决。多重PCR要求不同引物能在同一反应体系中进行特异性扩增，因而影响其扩增效果的因素较多。其中，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与敏感性，因此引物设计要合理，并且一个成功的引物浓度配比需要经过多次重复试验来调整。反应条件的优化是多重PCR成功的关键，要比常规PCR复杂得多。 生物芯片技术 人类基因组计划(HGP)的完成和蛋白质组计划(HPP)的启动，获得了海量的基因和蛋白质信息，要对规模如此庞大的信息进行全面的处理和研究，必须设计和利用更为高效的硬件和软件技术，建立新型、高效、快速的检测分析方法。生物芯片正是在这种背景下应运而生，它不仅在高通量基因测序、基因表达研究、蛋白质相互作用等方面发挥重要作用，亦将在植物检疫中占据重要地位。所谓生物芯片是指通过微加工技术将大量可寻址的生物识别分子如核酸片段、多肽分子甚至细胞、组织片断等按照预先设置的排列方式固定在厘米见方的芯片片基上，使芯片上每个坐标点就代表一个探针分子，利用生物分子之间的特异性亲和反应，实现对基因、配体、抗原等生物活性物质的检测分析。按反应载体可分为固相芯片和液相芯片。固相芯片发展较早，可以同时分析多种生物分子，具有高通量、高灵敏度和并行检测的特点，但是其信息质量的稳定性和可重复性比较差，且无法实现定量检测。 酶联免疫吸附测定技术 酶联免疫吸附测定技术是把抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机地结合在一起，使对抗原和抗体的检测和定量可以通过简单的颜色反应实现，是目前植物病毒检测中应用的最广泛的方法。与其他方法相比，该方法具有灵敏度较高、操作简单、特异性好、安全并可同时处理大批量样品、同