实验三 蛋白质脱盐(透析和凝胶过滤).pdfVIP

实验三 蛋白质脱盐（透析和凝胶过滤） Ⅰ。蛋白质的透析 实验目的 学习透析的基本原理和操作 实验原理 蛋白质是大分子生物，它不能透过透析膜而小分子物质可以自由透过。 在分离提纯蛋白质的过程中，常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分 开。 实验器材 1、透析管或玻璃纸 2 、烧杯 3、玻璃棒 4 、电磁搅拌器 5、试管及试管架 6 、离心机 7、冰箱 8 、电炉 实验试剂 1、1%氯化钡溶液 2 、硫酸铵粉末 3、1mol/L EDTA 4、2% NaHCO3 实验材料 1.透析管（宽约2.5cm,长12～15cm）或玻璃纸 2.皮筋 3.鸡蛋清溶液: 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按 1:20 混匀,然后用六层纱布过滤。 实验操作 1、透析管（前）处理：先将一适当大小和长度的透析管放在1mol/L EDTA 溶液中，煮沸10min 再在2% NaHCO3 溶液中煮沸10min，然后再在蒸馏水中煮沸10min 即可。 2 、加5ml 蛋白质溶液于离心管中，加4g 硫酸铵粉末，边加边搅拌，使之溶解。然后在4 ℃ 下静置20min ，出现絮状沉淀。 3、离心：将上述絮状沉淀液以1000r/min 的速度离心20min 4 、装透析管：离心后倒掉上清液，加5ml 蒸馏水溶解沉淀物，然后小心倒入透析管中，扎 紧上口。 5、将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，进行透析，并不断搅拌。 6、每隔适当时间（5～10min），用氯化钡滴入烧杯的蒸馏水中，观察是否有沉淀现象。 结果处理 记录并解释实验现象。 注意事项 硫酸铵盐一定要充分溶解，才能使蛋白质沉淀下来。 思考题 在透析袋处理过程中，EDTA 和NaHCO3 起何作用？ Ⅱ.凝胶过滤 实验目的 学习凝胶过滤的基本操作技术，了解凝胶过滤脱盐的原理和应用。 实验原理 凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。目前使用较多的凝胶是交联葡聚糖凝 胶（sephadex ）。这种高分子材料具有一定孔径的网络结构。高度亲水，在水溶液里吸水显 著膨胀。用每克干胶吸水量（ml ）的10 倍（G 值）表示凝胶的交联度，可根据被分离物质 分子的大小和工作目的，选择适合的凝胶型号。交联度高的小号胶如Sephadex G-25 适于脱 盐。 当在凝胶柱顶加上分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时，自由通透的小分子可以进 入胶粒内部，而受排阻的大分子不能进入胶粒内部。二者在洗脱过程中走过的路程差别较大， 大分子只能粘着胶粒之间的间隙向下流动，所经路程短，最先流出。而渗入胶粒内部的小分 子受迷宫效应影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出。通透性居中的分子 则后于大分子而先于小分子流出。从而按由大到小的顺序实现大小分子分离。 凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物；凝胶颗粒不带电荷，不与被分离 物质发生反应，因而溶质回收率接近100%，而且设备简单、分离效果好、重现性强，凝胶 柱可反复使用，