抗原获取和抗体制备.ppt

常规免疫法 脾内一次性免疫法 短程免疫法 体外免疫法 常用免疫方法： “稳妥；优势克隆” 皮下注射 腹腔注射 静脉注射 免疫途径： “省时；省抗原” “省时” “操作繁琐” 常规免疫法： 第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂 第2次免疫：抗原+福氏不完全佐剂 第3次免疫：抗原+不加佐剂 第4次免疫：抗原+不加佐剂 (皮下注射或静脉注射) (皮下注射) (皮下注射) (静脉注射) 二、细胞融合及HAT筛选 PEG介导细胞融合 最低程度的细胞损伤，产生最高频率融合的最佳效果 电激融合 病毒介导的细胞融合 1、细胞融合方法： 细胞悬液的制备与融合 (1) 脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3天制备 (2) 骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备 (3) 细胞融合：50%PEG(1000~4000), pH8.0, 38oC, 1min 2、HAT培养基的筛选 融合后细胞混合液 HAT培养基 2 weeks later HT培养基 正常培养基 1 week later 三、抗体的检测 要求： 简便、快速、敏感; 在短时间内能检测大量样品 常用方法： 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence, IFA) 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA) 双相扩散法 酶联免疫吸附法(ELISA) 抗原 第1抗体 酶 第2抗体 待检杂交瘤培养上清液 底物 有色产物 酶标仪检测 技术原理： 四、克隆化 常用克隆化方法： 有限稀释法 软琼脂平板法 显微操作法 80个细胞/96孔 饲养细胞(feeder cells) ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。 融合细胞的抗体筛选（有限稀释法） 融合细胞克隆生长 克 隆 化 按Poisson法计算，应有36%的孔为1个杂交瘤细胞/孔 有限稀释：0~8个细胞/孔 培养，细胞覆盖 10~20%孔底 ELISA 抗体高分泌细胞 克隆化 ELISA 特异性Ag包被 抗体阳性细胞株 针对目标Ag 特异性Ab的筛选 五、大规模培养——批量生产单克隆抗体 常用的大规模培养方法： 动物接种法（BALB/c小鼠，与BALB/c小鼠杂交的F1小鼠） 实体瘤法， 腹水制备法：浓度高，2-5mg/ml 转瓶培养法(量多，浓度低） 细胞培养罐法 单克隆抗体的鉴定 Ig类型鉴定：以兔抗小鼠Ig类及亚类血清为抗体，与培养液中的单抗做双扩测定。 特异性测定：与相应抗原及近似抗原测定 抗体效价测定：ELISA法应大于100万，低于10万则不可用。 决定簇测定： 亲和性测定： 培养上清中X抗体的检测 克隆化培养 单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体 规模化培养 获得大量单克隆抗体 动物免疫 细胞融合 混合细胞的HAT筛选) 分泌X抗体 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 X抗原 B淋巴细胞 瘤的突变株 培养数天后细胞死亡 无限生长细胞 分泌 X抗体 只有杂交瘤细胞可长期存活下来 BALB/c 杂交瘤技术操作流程图解 单克隆抗体在医学上的应用 诊断各类病原体。 寻找肿瘤特异性抗原，识别肿瘤相关抗原，用于肿瘤的诊断、分型及定位。 检测淋巴细胞的表面标志，区分细胞亚群和分化阶段。 用于主要组织相容性复合体（MHC）抗原的分型、诊断和ABO等血型鉴定。 测定激素、酶、药物等生物活性物质。 基因工程抗原制备 获得编码相应抗原的基因（文库筛选） 克隆至表达载体中 转化入改造过的大肠杆菌内表达蛋白 培养细菌至一定数量，收集细菌裂解，获得表达的蛋白 经亲和层析纯化蛋白 佐剂 指与抗原一起注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质，称为免疫佐剂（immunoadjuvant），简称佐剂（adjuvant） 一般认为，佐剂随抗原进入机体后，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，有利于抗原缓慢释放，延长抗原在体内的滞留时间，可以增强和扩大免疫应答的效应。 佐剂的作用 1、增强抗原的免疫原性，使无或微弱免疫原性的物质变成有效的免疫原； 2、增强机体对抗原刺激的反应性，可以提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度； 3、改变抗体类型，使由产生IgM转变成IgG； 4、引起或增强迟发型超敏反应 佐剂的种类 1、无机佐剂：氢氧化铝、明矾； 2、有机佐剂：分枝杆菌、百日咳杆菌和某些细胞因子； 3、合成佐剂：双链多聚甘氨酸等； 4、油剂：福氏佐剂、矿物油、植物油等 动物实验中最常用的佐剂。 福氏不完全佐剂（IFA）：羊毛脂1份+液状石蜡4份组成，高压灭菌低温保存。 福氏完全佐