细胞生物学课件_海南大学.ppt

3、悬液法 将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。 溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。 4、冷冻法 使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温法和液氮法。 此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。注意控制降温速率及保护剂的使用。 5、真空干燥法 这类方法包括冷冻真空干燥法和L－干燥法。 冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。 L-干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在10－20C?范围内进行真空干燥。 二、实验的基本原理 试管，棉塞，研体，烧杯，pH试纸，干燥器，高压灭菌锅，干燥箱，培养箱，真空泵，接种针，超净工作台，酒精灯，火柴，冻存管，安瓿管，吸管。 甘油，液体石蜡，干冰，培养基等。 哈氏弧菌。 三、实验材料 1、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C?冰箱中包藏。 保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。 此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。 四、实验步骤 2、液体石蜡保藏法 将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。 将试管直立，置低温或室温下保存。 此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通细菌也可保藏1年左右。 3、穿刺保藏法 按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置4℃冰箱存放。 四、实验步骤 4、砂土管保藏法 （1）河砂处理 取河砂若干加入盐酸10% ，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。 （２）土壤处理　 取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。 (3)砂土混合 处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常采用间歇灭菌2--3次)，最后烘干。 四、实验步骤 (4)无菌检查 每10支砂土管随机抽1支，将砂土倒入肉汤培养基中，30℃培养40h，若发现有微生物生长，所有砂土管则需重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌后方可使 用。 (5)菌悬液的制备 取生长健壮的新鲜斜面菌种，加入2-3ml无菌水(每18x180mm 的试管斜面菌种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。 (6)分装样品 每支砂土管(注明标记后)加入0．5ml菌悬液(刚刚使砂土润湿为宜)， 用接种针拌匀。 (7)干燥 将装有菌悬液的砂土管放入干燥器内，干燥器底部盛有干燥剂。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口)。 (8)保存 置4℃冰箱或室温干燥处，每隔一定的时间进行检测。此法多用于产芽孢的细菌、产生孢子的霉菌和放线菌。在抗生素工业生产中应用广泛、 效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。 5、冷冻真空干燥法 （1）冻干管的准备：中性硬制玻璃，烘干，灭菌。 （2）菌种培养：细菌芽孢脱落；放，霉孢子丰满。 （3）保护剂的配制：配制，灭菌，检查 （4）菌悬液的制备：2-3ml保护剂 （5）分装样品：菌悬液每管0.2ml （6）预冻：程序控温仪降温 （7）冷冻真空干燥：-50℃下抽真空 （8）取出样品：轻敲松散即达标 （9）第二次干燥： （10）熔封 （11）存活性检测：抽取一管进行存活性检查 （12）保存：4℃保存 四、实验步骤 1、液体石蜡保