口腔粘膜细胞基因组DNA制备（完整版）.ppt

生化与分子生物学技术 中山医学院 卢汉平 luhp@mail.sysu.edu.cn学习要求 掌握的主要内容 核酸技术（提取，纯化，鉴定） 蛋白质技术（提取，纯化，鉴定） 其他基本要求 离心技术，电泳技术，分光光度技术 加样，染色，各种试剂的使用 实验室秩序 （时间，物品保管，工作服，分组与值日） 仪器与设备的使用 实验室安全、环保 实验室管理与操作规程 本次实验安排 口腔粘膜基因组DNA的提取与纯化 apoB基因PCR加样与上机 基因组DNA的提取与纯化 目的： 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文 库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分 离基因等。 核酸分离纯化的基本原则： 保证核酸一级结构完整 排除其他分子的污染 蛋白质、脂类、糖、 有机熔剂、金属离子、 外源DNA、RNA等 核酸提取的主要步骤 破碎细胞： SDS裂解细胞，EDTA抑制核酸酶 除去蛋白质： 蛋白酶K水解蛋白质，酚和氯仿/异戊醇 抽提、分离蛋白质 析出DNA： 乙醇沉淀使DNA从溶液中析出 注意事项 减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱） 减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融；高温等） 防止核酸的生物降解（核酸酶的预防） 人基因组DNA的制备 实验目的及意义 1. 从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA 2. 掌握基因组DNA抽提的方法，理解核酸分 离纯化的基本原理 基因组DNA提取原理 利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻璃棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。 实验材料及试剂 材料：人口腔上皮细 试剂： 抽提缓冲液：Tris-Cl pH8.0 ，EDTA， NaCl， RNAase SDS，蛋白酶K， 饱和酚 氯仿/异戊醇（24:1） 75%及95%乙醇 TE缓冲液：Tris，EDTA 主要试剂的功能 抽提缓冲液：由SDS、EDTA、蛋白酶K组成. SDS: 裂解细胞. EDTA :络合镁钙等二价金属离子,防止 DNA 酶对DNA分子的降解作用。 蛋白酶K：水解蛋白质。 酚和氯仿/异戊醇：抽提分离蛋白质 乙醇：沉淀DNA TE：溶解DNA 实验步骤及注意事项（一人一组）： 取材: 用生理盐水漱口后，口含生理盐水10~15ml约2~3min，取10ml含漱用10ml离心管（4000rpm ? 10min）收集细胞沉淀 （台式离心机的使用，平衡，视频：离心技术） ? 加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀 ，转移至1.5ml EP管， （微量移液器的正确使用） ?混匀，65℃ 温育10min 加入等体积的饱和酚(0.5ml)，充分颠倒混匀 （不要震荡！注意饱和酚的性状！） 12000rpm?5min，上层水相转移至新的EP管 高速离心机的使用与安全意识? 加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀 12000rpm?5min，上层水相转移到新的EP管 加入2倍体积95%的乙醇，颠倒混匀12000rpm?5min ? 弃上清，沉淀中加入75%乙醇12000rpm?2min ? 轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置5~10min 加入30?l0.1×TE溶液4 ℃ 保存? 实验结果及其分析 定性分析：DNA琼脂糖凝胶电泳 定量分析：紫外分光光度法测定 DNA溶液的浓度 常见问题： 1. 提取的DNA不纯： 变性不充分；关键过程反应时间过短； 离心时间或速度不够。 2. 提取的DNA成涂布状： 操作过程中用力过猛，动作粗暴；