免疫组化的原理与操作精编版.pptVIP

（三）免疫组化染色基本技术及注意事项 1．实验计划 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab-I鼠抗人的抗体，与其他种属间无交叉，则不能用其他动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若 PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物 ② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差 异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否则无可比性。 ③ 选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。 2．Ab稀释度 （如系购买的药盒有工作液和原液） （1）工作液：无须稀释 （2）原液： 应参照其提供的工作液浓度进行预试验 原液的保存（-20℃）冻存——应选最佳稀度冻存。 ③若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍，而 后分装10μl/瓶→冻存（-20 ℃）于 冰箱备用。 （3）Ab浓度的选择 Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定 浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少； 极过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。 ——并非Ab浓度越高越好。 3．Ab滴片技术 —— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。 ［注意］滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。 要领：甩净组织周围的水。 4．Ab孵育技术 （1）必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。 （2）温度与时间 4℃过夜（＞16h）