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荧光光度分析法测定维生素 B2 的含量 引言 荧光分光光度法简介 有些物质， 当用紫外光照射时， 它吸收某种波长之后还会发射出各种颜色和 强度不同的光； 而当紫外光停止照射后， 这种光线也随之消失， 这种光线称为荧 光。荧光的波长比吸收的紫外光波长要长。 由于物质分子结构不同， 所吸收的紫外光波长和发射的荧光波长也有所不同。 利用物质的这个特性， 可以对物质进行定性分析。 同一种分子结构的物质， 用同 一种波长的紫外光照射， 可发射相同波长的荧光； 若该物质的浓度不同， 所发射 的荧光强度也不同， 利用这个性质可以对物质进行定量分析。 这种定量方法称为 荧光分析法， 简称荧光法。 测量荧光的仪器有滤光片荧光计， 滤光片—单色器荧 光计和荧光分光光度计。荧光法的选择性好，灵敏度比紫外 - 可见分光光度法高 2~3 数量级，检出限低，可以达到 10~12g／m1，线性范围宽。现在主要应用的是 荧光分光光度计。 【实验目的】 1. 学习荧光光度法测定维生素 B2 的含量的基本原理和方法。 2. 熟悉荧光光度计的结构及使用方法。 【实验原理】 在经过紫外光或波长较短的可见光照射后， 一些物质会发射出比入射光波长 更长的荧光。在稀溶液中，荧光强度 IF 与物质的浓度 c 有以下关系： IF 2.303 I0 bc 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： IF Kc 这种以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法。 荧光 强度与激发光强度成正比，提高激发光强度，可成倍提高荧光强度。同时，提高 仪器灵敏度， 可提高荧光光度法的灵敏度。 而吸收光度法， 无论是提高激发光强 度还是提高仪器灵敏度，入射光和出射光同时增大，其灵敏度不变。因此，荧光 光度法比吸收光度法灵敏度高。 VB2( 即核黄素 ) 在 430～440nm 蓝光照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为 535nm。VB2 的荧光强度在 pH6～7 时，在 pH=11时基本消失。 维生素 B2 （又叫核黄素，VB2 ）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为： VB2 易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂， 在中性或酸性溶液中稳定， 光照易分解， 对热稳定。 维生素 B2 溶液在 430～440 nm蓝光的照射下， 发出绿色荧光， 荧光峰在 535 nm。维生素 B2 的荧光强度在 pH=6～7 时最强，在 pH=11的碱性溶液中荧光消失， 所以可以用荧光光度法测定维生素 B2 的含量。 维生素 B2 在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的 荧光比核黄素的荧光强的多，故测定维生素 B2 的荧光时溶液要控制在酸性范围 内，且在避光条件下进行。 【仪器与试剂】 1. 仪器 荧光光度计；容量瓶 (50 、1000mL)；吸量管 (5mL) ；棕色试剂瓶；洗瓶 2. 试剂 2 2 VB 对照品；市售 VB 片； 1％HAc溶液 【实验步骤】 1. 标准系列溶液的配制 (1) 10.0mg ／L VB2 标准溶液的配制 准确称取 10.0mgVB2，将其溶解于少量的 1％HAc溶液中，转移至 1000mL容 量瓶中，用 1％HAc溶液稀释至刻度，摇匀。该溶液应装