Lenti-X HTX 慢病毒包装系统操作流程(clontech).docVIP

Lenti-X? HTX 高效慢病毒包装系统 操作一览 PT5135-2 目录 重要 .................................................................................................................................. 1 存储 处理 ........................................................................................................................ 1 转染操作 ........................................................................................................................... 2 重要: 以下操作是针对 Lenti-X 载体, Lenti-X HTX 高效包装系统和 Lenti-X 293T 细胞系 (Cat. No. 632180的优化操作。 转染操作需在 100 mm 培养板 中进行, 转染培养基和收集病毒的培养基中需使用 Tet System Approved FBS (无四环素污染 。 以下所有操作需在无菌环境下进行, 需要使用生物安全等级为 2的仪器设备进行病 毒操作并做好自身的防护措施。 存储 处理: ● 使用前, 室温解冻 Xfect? Polymer (100 μg/μl 。 解冻后, 将 Xfect Polymer 置于 4°C 保存, 最多 12 months。 ● 使用前,室温解冻 Xfect Reaction Buffe。解冻后摇匀,将 Xfect Polymer 置于 4°C 保存, 最多 12 months。 ● 使用完 Xfect Polymer后,盖紧管盖,放回带有干燥剂的锡箔袋。 Figure 1. Lenti-X 293T细胞最优转染密度 (左图 和转染后细胞检测时间 (右图 , 转染筛选标记是 ZsGreen 绿色荧光蛋白。 转染操作(100 mm板: 1. 转染前约 24 hr, 以 4– 5 x 10e6Lenti-X 293T细胞 /100 mm板 的密度接种 10 ml细胞, 37°C 、 5% CO2 培养过夜。转染时的细胞融合度应该为 80– 90%。 2. 漩涡混匀 fect Polymer。 3. 对于每个转染样本,准备 2个离心管,按照以下顺序混匀试剂: 注意 Xfect Polymer预混液室温放置不要超过 30min 。 4. 漩涡混匀各管混合物。 5. 将 Xfect Polymer预混液和 DNA 预混液以适中的速度漩涡 10sec 。 6. 室温孵育 10 min,以形成便 Xfect/DNA复合物。 7. 将 1200ul 纳米复合物逐滴加入细胞培养基中,然后前后摇晃混匀。 注意 : 无需去除培养基中的血清,当纳米复合物加入培养基后,培养基的颜色会有些改变,这是 正常的。 8. 37℃孵育培养板。 9. 4 hr 后,吸走培养基,然后加入 10ml 新鲜培养基 (含 Tet System Approved FBS ,将培 养板放回 37℃培养箱继续培养 24-48 hr。一般来说,在转染后 48hr 时病毒滴度最高。 警示 :含有病毒的培养基需经过处理。 10. 收获病毒上清。 警示 :上清中包含传染性的病毒。 短暂瞬时离心 (500 x g, 10 min或 使用 0.45 μm过滤器过滤来去除细胞碎片。 注意 : 过滤器使用醋酸纤维素膜或多聚磺酸纤维素膜 (蛋白结合能力低 ,切勿使用硝酸纤维素 膜,以防硝酸纤维素膜结合的蛋白破坏病毒。 11. 使用 Lenti-X GoStix? 检测病毒产量, 鉴定病毒滴度。 使用合适滴度的病毒进行感染靶 细胞,或置于 – 80°C 保存。 注意 : 每次冻融病毒后,病毒滴度会降低 2-4倍。