HPLC_UV法定量测定发酵液中的S_腺苷_L_甲硫氨酸_蔡恒.docVIP

中国生物工程杂志 China Biotechnology ,2007,27(11:73~76 HPLC-UV 法定量测定发酵液中的 S-腺苷-L-甲硫氨酸 蔡 恒 郑伟刚 万红贵* 郭一丹 王 涛 (南京工业大学制药与生命科学学院 南京 210009 摘要 采用高效液相色谱-紫外检测器(H PL C-UV 定量测定发酵液中S-腺苷-L-甲硫氨酸(S A M 的含量。结果表明,S-腺苷-L-甲硫氨酸浓度在0.1~1.0g /L 时,其峰面积(Y与相应的浓度(X 呈线性关系,线性方程为Y=13.937X -0.1949,相关系数为0.9969。S-腺苷-L-甲硫氨酸的平均回收率为99.89%~101.7%,相对标准偏差为0.48%~1.36%。该方法精密度、准确度好,稳定性高,能简便、快速、准确地测定发酵液中S-腺苷-L-甲硫氨酸的含量。关键词 S-腺苷-L-甲硫氨酸 HPL C U V 中图分类号 Q815 收稿日期:2007-05-29 修回日期:2007-09-24*通讯作者,电子信箱:l ub i nne w@to m .co m S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl -L-methi onine是人体内的重要中间活性物质,具有转甲基,转氨丙基和转硫基作用。主要用于治疗肝炎、抑郁症和关节炎,有增强身体免疫力的功能,是一种重要的药物中间体,需求量很大,市场很广 [1~3] 。S-腺苷-L-甲硫氨酸主要通过 发酵法生产,目前介绍S-腺苷-L-甲硫氨酸测定方法的文献不是分离效果不理想,就是流动相价格昂贵。本文尝试采用一种新的流动相,建立S-腺苷-L-甲硫氨酸的HPLC-UV 定量分析方法,为发酵液中S-腺苷-L-甲硫氨酸的含量测定提供一种简单、快速、准确的方法。 1 材料与方法 1.1 仪 器 高效液相色谱仪(A lltech,包括426HPLC 泵,UV 2000检测器等;TGL-16G 冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂;BS124S 电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司,L G 冰箱。1.2 试 剂 乙腈(色谱纯,Caledon Labor atories 公司,S-腺苷-L-甲硫氨酸标准品(Sig ma 公司,三氟乙酸(AR ,国药集团化学试剂有限公司,七氟丁酸(AR ,F l uka 公司, 所用水由M illi-Q 纯水机制备。1.3 色谱条件 色谱柱:Prevail C 18(250mm @4.6mm ,5L m 流动相:0.14%三氟乙酸(含0.06%七氟丁酸溶液-乙腈溶液(80B 20 流速:0.8m l /m in 检测器:UV A lltech 波长:254n m 进样量:20L l 温度:25e 1.4 样品溶液的配制 S-腺苷-L-甲硫氨酸发酵液经4000r /m in 的速率离心10m in 后,取菌体用等体积20%的高氯酸萃取1.5h ,在4000r /m in 的速率离心10m in ,取上清液经0.22L m 水膜过滤后待用。1.5 标准溶液的配制 S-腺苷-L-甲硫氨酸标准品25mg 全部用超纯水溶解,振荡并定容至10m ,l 得到浓度为2.5g /L 的S-腺苷-L-甲硫氨酸标准品储备液。然后分别制得质量浓度为0.1g /L 、0.4g /L 、0.5g /L 、0.8g /L 、1.0g /L ,所用水均为超纯水。 2 结果与讨论 2.1 色谱条件的选择 S-腺苷-L-甲硫氨酸分子中有共轭双键,有紫外吸 DOI :10.13523/j.cb中国生物工程杂志China Bi o technology Vol.27No.112007 收,可以直接使用紫外检测器检测。根据S-腺苷-L-甲硫氨酸分子结构,查有关资料,它的最大吸收波长为254n m 。关于S A M 的检测方法都是HPLC-UV,但是流动相和柱子的选用有所不同。扬州大学蔡瑞 [4] 是以甲 酸铵(甲酸调pH 值到4.0为流动相,阳离子色谱柱,但是检测时间太长,并且分离度不好;浙江工业大学陈小龙 [5] 以甲酸铵(甲酸调pH 值到3.0为流动相,反相 C-18拄,但是同样存在检测时间太长的问题;浙江大学赵晓星 [6] 是以40mmol /L 磷酸二氢铵2mmol /L 庚烷磺 酸钠18%(V /V 甲醇水溶液当流动相,C-18色谱柱,检测方法好,但是流动相原料庚烷磺酸钠价格昂贵,不易采用。本实验起始用甲醇/水当流动相,有机相的比例从100%开始,每次递减20%,但是效果也不理想。以已腈/水当流动相,体积比为100B 0、90B 10、80B 20、70B 30的0.14%三氟乙酸(含0.06%七氟丁酸溶液-乙腈溶液作为流动相进行实验。同时采用不同的流速,分别为0.8m l /m in ,1.0m l /m i