依博素生物合成基因ste22的异源置换研究.pdfVIP

228 中国医药生物技术 2015 年 6 月第 10 卷第 3 期 Chin Med Biotechnol, June 2015, Vol. 10, No. 3 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.007 ·论著· 依博素生物合成基因 ste22 的 异源置换研究 郭连宏* * ，张洋 ，鲍勇刚，白利平，姜蓉，李元 【摘要】 产物的生物功能已进行了较深入研究[5-7]，其中基因 目的 依博素是由链霉菌产生的一种新型胞外多糖，具有显 ste22 编码产物被确认为鼠李糖糖基转移酶[8] 。糖基 著抗类风湿性关节炎的作用，我们研究已确定了该多糖的生 转移酶在微生物胞外多糖（EPS ）的生物合成过程 物合成基因簇（ste ）。为了对依博素结构进行改造以提高其 中起重要作用，在多糖生物合成基因簇中引入异源 生物活性，对其生物合成基因 ste22 进行了异源置换研究。 糖基转移酶基因有可能改变多糖结构获得新衍生 方法 采用 PCR 扩增方法从乳酸菌获得了编码葡萄糖糖 物，并可验证被置换基因功能及多糖构效关系。鉴 基转移酶的基因 gtf ，通过基因同源重组双交换，从链霉菌 于乳酸菌与链霉菌同属革兰阳性菌，且其多糖生物 中置换了 ste22 基因。采用白细胞介素-1 合成酶活性测定 合成基因簇中葡萄糖糖基转移酶基因研究较深入， 方法及小鼠巴豆油急性炎症模型，初步确定了基因置换株的 因此本文采用 PCR 扩增方法，从产生胞外多糖的 依博素衍生物生物活性。 乳酸菌基因组获得其多糖生物合成簇的葡萄糖糖 基转移酶基因。以缺失基因 ste22 （编码鼠李糖糖 结果 获得了葡萄糖糖基转移酶基因置换株 Streptomyces 基转移酶）的依博素产生菌突变株为受体菌，通过 sp.139 （gtf-22 ），产生了依博素新衍生物 EPS-22g 。研究表 明该衍生物与依博素相比，葡萄糖比例从 2.14% 显著上升 基因同源重组双交换将葡萄糖糖基转移酶基因 gtf 到 48.64% ，体外活性实验显示，其对炎症细胞因子白细胞 置换至依博素生物合成基因簇中，Southern 杂交验 介素-1 合成关键酶 ICE 抑制率高于依博素，小鼠巴豆油急 证 获 得 了 基 因 置 换 菌 株 Streptomyces sp.139 性炎症体内活性分析结果证明，该衍生物抑制活性亦高于依 （gtf-22 ），分离纯化了该菌株产生的胞外多糖 博素。 EPS-22g ，结果表明其单糖组分与依博素相比葡萄 糖比例有显著提高，体内外活性研究结果初步证明 结论 采用异源基因置换生物合成基因的方法改造依博素 该衍生物较依博素活性有所提高。 产生菌，可能是获得生物活性较好新多糖衍生物的一种有效 手段。 1 材料与方法 【关键词】异源基因置换； 基因 gtf ； 基因 ste22 ； 链 1.1 实验材料 霉菌； 乳酸菌 1.1.1 菌株 Streptomyces sp.139 （依博素产生 中国医药生物技术, 2015, 10(3):228-235 菌）、ste 22 基因阻断株 Streptomyces s