以蛋白激酶A为靶点的抗结核药物高通量筛选模型.pdf

中国医药生物技术 2014 年 12 月第 9 卷第 6 期 Chin Med Biotechnol, December 2014, Vol. 9, No. 6 417 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.002 ·论著· 以蛋白激酶A 为靶点的抗结核药物 高通量筛选模型的建立和应用 罗睿，徐建，魏玉珍，李海龙，刘红宇，苏静，赵莉莉，张玉琴，余利岩 【摘要】 因此，寻找能有效治疗多重耐药结核、广泛耐药结 目的 建立以蛋白激酶 A 为靶点的抗结核药物高通量筛 核等新型有效的抗结核药物显得尤为迫切。 选模型，应用该模型筛选具有特异性酶活抑制活性的微生物 蛋白激酶 A （protein kinase A ，PknA ）是结核 发酵液粗提物样品。 分枝杆菌产生的 11 种丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶 方法 以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板，扩增 （serine/threonine protein kinases，STPKs）之一， 目的基因片段 pknA ，构建表达载体 pET43.1a-pknA ，在大 是结核分枝杆菌生长所必需的[8] 。不仅影响结核分 肠杆菌中克隆表达了重组 MTB PknA 蛋白；采用三步级联 枝杆菌细胞分裂和细胞壁合成，还可能干扰宿主细 的反应方法，利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸到氧化型烟 胞的信号传导。pknA 基因在指数生长期显著表达， 酰胺腺嘌呤二核苷酸这一反应最大吸光值波长的变化，建立 过表达 PknA 会降低生长速度并改变细胞形态，而 和优化蛋白激酶 A 抑制剂高通量药物筛选模型。 敲除 pknA 基因的结核分枝杆菌菌体则变得细长[9-11]。 PknA 对结核分枝杆菌的生长分裂和细胞形态的维 结果 成功构建了表达载体 pET43.1a-pknA ；建立了稳定灵 敏，可用于靶向结核分枝杆菌蛋白激酶 A 的抗结核药物高 持具有重要作用，同时，PknA 与人同源蛋白激酶 （CK1 ）基因系列差异较大，相似性低于 30%[12] 。 通量筛选模型；利用该模型对 4000 个微生物发酵液粗提物 样品进行筛选，最终得到 21 个抑制蛋白激酶 A 活性的阳 因此，可作为理想的新型抗结核药物筛选靶点，期 性样品，阳性率 0.53% ；以耻垢分枝杆菌和海分枝杆菌为检 望获得选择性较好的蛋白激酶抑制剂。 定菌，平板纸片法检测阳性样品的抗分枝杆菌活性，然后对 微生物的次级代谢产物有结构新颖、多样和低 阳性样品的细胞毒性和酶活抑制特异性进行评价后，最终得 毒等特点，是新药开发的重要资源之一，当前天然 到 8 个阳性样品，其中 I10AA-02916 、I09AA-02717 、 产物来源的病原菌蛋白激酶抑制剂报道较少[13-14] 。 I09AB-02729 、I08AB-00801 这 4 个阳性样品酶活抑制特 本研究通过建立以 PknA 为靶点的高通量筛选模 异性、抗菌活性均较好，且细胞毒性较低。 型，期望在微生物次级代谢产物中开发新型酶活抑 制活性特异和抗菌活性均较好的抑制剂，为开发有 结论 建立了高稳定性的以蛋白激酶 A 为靶点的抗结核 效的抗耐药结核分枝杆菌先导化合物奠定基础。 药物高通量筛选模型，应用该模型所得到的发酵液阳性样品 值得进一步研究。 1 材料与方法 【关键词】 环 AMP 依赖性蛋白激酶类； 药物评价，