2016-Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用.pptVIP

Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用 2016-04-25 Content 第一节、Cre-loxP技术 第二节、 CRISPR-Cas9技术 第三节、病毒工具简介 第四节、组合应用示例 基因操作技术一览 Cre蛋白于1981年从P1噬菌体中被发现，属于λInt酶超基因家族。 Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp, 编码343个氨基酸, 38kDa, 单体蛋白。 Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能特异地在两个loxP位点间发生基因重组。 Cre重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。 loxP位点，是locus of X-over P1的缩写，来自P1噬菌体。间隔序列决定loxP的方向，如下所示： 1. Cre-loxP技术简介 13bp             8bp             13bp ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT Cyclization recombinase 1.1 Cre-loxP技术基本原理 1.2 Cre-loxP技术应用 启动子 靶组织或细胞 albumin 肝脏 insulin 胰岛b细胞 adipose protein 2 脂肪细胞 b-lactoglobin 乳腺 keratin 5 皮肤 muscle creatine kinase 骨骼肌 myosin 心脏 protamine-1 精子 CD19 B淋巴细胞 proximal lck T淋巴细胞 Wnt-1 or engrailed-2 神经系统 与组织特异性启动子结合应用，实现Cre转基因的空间控制 1.2 Cre-loxP技术应用——组织特异性应用 启动子 诱导物 Cre表达的靶组织 Mx1 IFN 肝脏、免疫细胞 CMV-tTA tetracycline 广泛表达 CMV-ER tamoxifen 广泛表达 与诱导性表达启动子结合应用，对Cre转基因的表达进行控制 —MerCreMer重组蛋白 1.2 Cre-loxP技术应用——可诱导性应用 1.3 Cre-loxP技术仍有不足之处 传统的基因打靶技术主要依赖于基因同源重组，利用设计的同源臂替代靶基因片段，从而达到目的。 但是同源重组在细胞中的发生概率极低，而且步骤比较复杂、耗时间、费用也比较高。 非同源末端连接（non homologous end joining, NHEJ） 2. CRISPR-Cas9技术 均由自然界存在的核酸酶系统改造而来 均具有识别核酸碱基特异性的结构域 作用机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口， 从而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰 新3代基因组编辑工具 2.1 CRISPR-Cas9技术来源 N代表任意DNA碱基 Guide RNA: crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating crRNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物。通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ） Cas9: 复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。HNH结构域剪切配对的部分， Ruvc结构域剪切未配对的链。 DNA、RNA和蛋白质聚合物 2.2 CRISPR-Cas9系统组成 1.  靶基因分析：明确CDS外显子部分； 2.  sgRNA位点设计：确定待敲除位点，对于蛋白编码基因，如果该蛋白具有重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。 3.  Cas9载体构建：根据sgRNA序列，设计引物，合成带粘性末端的双链片段。对表达载体先进行限制性内切酶酶切，得到线性化载体，再把前面得到的双链片段连接入表达载体。再进行感受态细胞的转化和阳性转化子的鉴定； 4.  Cas9载体活性检测：转染细胞，采用特异性片段扩增后进行的T7E1酶切处理，进行重组效率的检测。 2.3 CRISPR-Cas9技术流程 1.  CRISPR-Cas9系统的可用位点更多：理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可用CRISPR-Cas9进行编辑的位点，而TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个可用位点； 2.  CRISPR-Cas9系统更具有可拓展性：例如可以通