皮肤光变态反应试验方法SkinPhotoallergyTest范围本方法.doc

——PAGE 20— —PAGE 2—— 附件2 皮肤光变态反应试验方法 Skin Photoallergy Test 范围 本方法规定了动物皮肤光变态反应试验的基本原则和试验要求。 本方法适用于化妆品原料和产品的皮肤光变态反应检测。 试验目的 本试验用于评估与预测人体重复接触化妆品原料及其产品，并在日光照射下引起皮肤光变态反应的可能性。 定义 3.1皮肤光变态反应（皮肤光过敏反应，Skin Photoallergy） 皮肤接触受试物并经过紫外线照射，通过作用于机体免疫系统，诱导机体产生光致敏状态，经过一定间歇期后，皮肤再次接触同一受试物并在紫外线照射下，引起特定的皮肤反应，其反应形式包括：红斑，水肿等。 原理 广义的光敏性（Photosensitivity）包括光毒性（Phototoxicity，又称为光刺激性，photoirritation）与光变态（Photoallergy）。 皮肤光变态反应是一种细胞介导的由光激活的皮肤免疫性反应，是IV型过敏反应的特殊类型，系光感物质经皮吸收或通过循环到达皮肤后与吸收的光线在皮肤细胞层发生的不良反应。目前较为公认的原理为：光感物质吸收光能后成激活状态，并以半抗原形式与皮肤中的蛋白结合成蛋白结合物，经表皮的郎罕氏细胞传递给免疫活性细胞，引起淋巴细胞致敏等免疫反应。致敏的淋巴细胞再次接触同一抗原时释放出淋巴因子，导致一系列有害反应。 试验的基本原则 5.1 实验动物颈部去毛，通过多次皮肤涂抹诱导剂量的化妆品原料或产品后（可提前给予佐剂、皮肤损伤处理以增强敏感性）且多次暴露于一定剂量的紫外线下，诱导特定免疫系统（诱导阶段），经过一定间歇期后，在动物背部去毛皮肤给予激发剂量的受试物后暴露于一定剂量的紫外线下，观察实验动物并与对照动物比较对激发接触受试物的皮肤反应强度。 5.2 实验动物与饲养环境 选用符合国家标准要求的成年雄性或雌性白色豚鼠，体重350g—500g，雌性动物应选用未孕或未曾产仔的。 动物及实验环境、饲料和饮水应符合国家相应标准。注意以合适的方式补充适量Vc。 5.3 动物试验前准备 试验前动物要在实验环境中适应3—5d。将动物随机分为受试物组、阴性（溶剂）对照组、阳性对照组，诱导接触开始24h前在动物颈部给动物备皮（去毛），避免损伤皮肤。试验开始和结束时应记录动物体重。 5.4 无论在诱导阶段或激发阶段均应对动物进行全面观察包括全身反应和局部反应，并作完整记录。 试验方法 本试验选用佐剂和角质剥离（Adjuvant and Strip）法。进行本试验前，需通过预实验排除受试物引起皮肤原发性刺激反应及光毒性的可能。 6.1 动物与分组 动物分为受试物组，阳性对照组，阴性对照组；每组至少5只动物。如果试验目的包含获取受试物致敏强度值，并对受试物进行光致敏强度的分级，则每组至少需要10只动物。 阴性对照组诱导阶段在颈部备皮中央区域涂敷溶剂，30min后进行紫外线照射；阴性对照组激发阶段在背部备皮区域3，4涂敷溶剂，涂敷30min后进行紫外线照射。 激发阶段豚鼠背部区域1为不涂敷不照射区，区域2为不涂敷仅照射区，区域3为涂敷不照射区，区域4为涂敷照射区（见图2A）。 6.2 剂量水平 诱导接触阶段的受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度，激发接触阶段的受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度。试验浓度水平可以通过少量动物（2—3只）的预试验获得。 受试物、阳性物、阴性对照的诱导与激发浓度选择：通过预试验，排除原发皮肤刺激性与光毒性后的合适的浓度。通常选取的阳性物在所选取的浓度下其致敏率应为轻度或中度。 6.3 阳性物 阳性物选择6-甲基香豆素或四氯代水杨酰苯胺（tetracholosalicylanilide，TCSA）。常用阳性物的溶剂为丙酮、乙醇或二者按一定比例的混合物。 每次试验均需设阳性对照物组。 6.4 增敏剂的配制 本试验以1:1（v/v）完全弗氏佐剂（FCA）与生理盐水的混合乳剂作为诱导阶段的增敏剂。 6.5 UV 光源 6.5.1 光源选择 诱导阶段与激发阶段均选择波长为320nm—400nm的UVA，如含有UVB，其剂量不得超过0.1J/cm2。光源可选用黑光灯管、超高压汞灯加滤光片或其它符合以上条件的UVA光源。 6.5.2 照射剂量 诱导阶段与激发阶段照射剂量均设为10.2J/cm2。 6.5.3 强度的测定 用前需用辐射计量仪在实验动物肩部（诱导阶段）、背部（激发阶段）照射区设数个点测定光强度（mW/cm2），以平均值计。 6.5.4 照射时间的计算：以照射剂量为10.2J/cm2为例，按下式计算照射时间。 照射时间（min）= 照射剂量（10200mJ/cm2） 光强度[mJ/（cm2·s）]×60 注：1mW/cm2=1mJ/cm2/sec