细胞培养基本技术培训课件.pptVIP

1.细胞密度接种分散细胞,接种的密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。相反，即便是在很小的培养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长 2.细胞类型传代培养的细胞之潜伏期比原代培养的细胞短。 传代培养期的细胞,一般为6-24h;原代24-96h或更长单个细胞快,细胞大团慢,组织块慢连续细胞系与发生恶性转化的细胞(6-24h)比有限细胞系 　　　与正常二倍体细胞的短来源：胚胎组织:短,2天可见细胞生长　　　成体:长 3.细胞机能状态 不良者慢4.培养条件 培养液,pH,底物 不利:污染,有毒 2．指数增生期（Logarithmic growth Phase）：　　这是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%～0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%。 　　在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。 　　细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。 特点：　 　是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段 　培养物中细胞数量呈指数增长,细胞群体均一 　是理想的实验用细胞 判断细胞生长的指标：指数生长期内细胞分裂活动的程度(增殖活性)可作为判断细胞生长是否旺盛的重要指标 1.有丝分裂指数(MI): 　　指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计时，每瓶至少需计数1000个细胞。　一般细胞的MI约为0.1－0.5%；原代培养物的MI比继代培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3%－5%。 判断细胞生长的指标： 2.细胞群体倍增时间:　培养物中细胞数量翻倍的平均时间 3.MTT法：反映细胞内一种酶活性程度 4.标记核苷酸(3H-TdR)掺入量：反映DNA 3．停滞期（Stagnate Phase）：　　细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传1～2两代，通过换液淘汰死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。 概述 细胞铺满后再1-2倍增, 进入细胞达饱和密度, 可存活仍有代谢活动，但基本不分裂，  细胞数量维持在某一水平上，生长活动停滞 特点 (1)细胞数量： 细胞达饱和密度，出现密度抑制。  停止生长原因: 细胞数量多、生长地区占满、营养消耗、培养液中代谢废物积聚渐多，细胞停止生长。　　即使经常更换培养液，细胞也会变性,从生长基质表面脱落、死亡唯有进行传代方可缓解。  (2)细胞活动小, 细胞膜的　活动小 (3)生长组分下降: 0－10% (4)及时传代：细胞已中毒，即使传代，也会影响下一代细胞的功能状况 　　体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。 体外培养细胞的种类 （一）初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。 （二）细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此