20140716_生物标志物与分子检测平台服务.pptxVIP

2014年中培训生物标志物与分子检测服务;验证与功能研究——必要性;生物标志物与分子检测平台服务项目; 技术功能 技术方法：Sanger 或Pyrosequencing测序 应用 基因的cDNA测序 肿瘤医院合作遗传性乳腺癌相关基因测序，寻找突变 甲基化位点检测 菌种鉴定等等;荧光定量PCR技术;　　在PCR反应中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。;Real-time PCR用途;荧光定量PCR实验基本流程;荧光定量PCR-两种荧光原理;荧光定量PCR的化学原理——SYBR Green;荧光定量PCR的化学原理——SYBR Green;荧光染料法的特点及应用 （1）、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高； （2）、可做双链核酸的熔解曲线分析； （3）、SYBR GreenⅠ染料本身价格便宜，但是做荧光定量PCR时对引物设计的要求很高；否则引物二聚体及非特异性扩增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时； （4）、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛； （5）、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。;Taqman探针类;;荧光定量PCR的化学原理——Taqman;扩增曲线、阈值、CT值 ; 扩增曲线（primary curve）;扩增曲线的两种形式;荧光定量PCR常用的三个概念：阈值;基线(baseline)：一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号,即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。 荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值 -- 缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍, （机器自动设置）。 -- 手动设置：大于样本的荧光背景值;Ct值(Cycle Threshold)：在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。;Ct值可以确定初始模板量？;23;24; 相对定量;;相对定量2 - △△Ct实例;引物及Taqman探针的设计;2、Taqman探针及引物的设计原则： 在Taqman探针法中，Taq酶除了5’-3’聚合酶作用之外，还要5’-3’外切酶的活性来切断探针链产生荧光，普通PCR的延伸温度为72℃，此温度为Taq酶聚合作用的最佳温度；Taq酶5’-3’外切酶活性的最佳温度为60℃??所以Taqman PCR反应的一般采用两步 法，即95℃变性，60℃复性延伸。 在Taqman探针及引物的设计过程中，引物的TM值已经确定为60℃左 右，在每轮PCR循环的复性过程中（95→60℃），为了确保探针先于引物与模板结合，这就要求探针的TM值高于引物10℃左右，所以Taqman探针及引物一般都是引物TM值为60℃左右，探针的TM值为70℃左右。;2、Taqman探针及引物的设计原则： （1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异； （2）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显 子； （3）、引物TM值为60℃左右，探针的TM值为70℃左右； （4）、探针的5’端应避免使用鸟嘌呤G，因为5’G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用； （5）、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量 G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针； （6）、引物之间的TM相差避免超过2℃； （7）、典型的引物长度为18-24bp，探针长度为15-45bp； （8）、PCR产物长度在50-150bp之间，这样有利于使PCR效率相同； （9）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其 特异性 ;3、Taqman探针及引物合成时注意事项 （1）、引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成； （2）、先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCR，电泳检测PCR产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特异 性扩增情况，必要时进行PCR产物的测序验证； （3）、确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多以 外的损失； （4）、探针合成好后，先检测一下探针的质量，250nm的探针终浓度， 25ul水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量PCR仪上检测， 95℃，2min; 95℃，20s，60℃，20s，40个cycles；看荧光本底和 荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着PCR反应，荧 光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量