* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 2. 研究亚细胞蛋白质组学的意义(research value) 1)富集低丰度蛋白质,完善全细胞蛋白质组(enrich low abundant proteins); 2)提供蛋白质的亚细胞定位信息(provide location information); 3)加深对亚细胞组分的结构功能理解(understand the structure and function of subcellular units); 4) 加深对细胞生理分子机制的理解(understand the molecular mechanism of cell) 5) 亚细胞蛋白质组的差异表达谱(analysis of differential expression pattern of subcellular proteome ) 3.亚细胞蛋白质组学的技术基础 亚细胞组分的分离: 用超离心技术等方法分离出细胞器、质膜和细胞核等成分,再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。 1)细胞的破碎; 2)亚细胞组分的分步分离:差速离心与密度梯度离心联用;如蔗糖密度梯度离心 3)免疫共沉淀法分离信号复合体(complex); 4) 亲和层析法分离不同亲和特性的亚细胞组分; Ca2+鳌合层析住分离大鼠线粒体中的钙结合蛋白 5)分离纯化效果的评价,显微镜检测,或检测合适的标志酶 Subcellular fractionation Complex isolation organelles Two main steps : Homogenization of tissues and cells Separation of cellular organelles Centrifugal methods that separate organelles by size and/or buoyant density in gradient Immuno-isolation methods that use antibodies Electrophoresis methods that separate proteins on the basis of surface charge distribution 亚细胞定位预测分析 生物信息学的应用: 跨膜片断的判断方法 TMHMM, http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/ Psort, / Sequence Number of predicted TMHs: 11 4. 细胞膜蛋白质组学(membrane proteomics) 研究进展 Importance,物质、能量、信息的传递 Difficulty,膜蛋白的高疏水性 主要分类: out membrane protein; Peripheral membrane protein; Integral membrane protein; Proteomics research strategies samples(tissues、cell or body fluid) Extract proteins 2D-Electrophoresis, 2D-HPLC Trypsin digestion MALDI-TOF/TOF PSD-MALDI-TOF Q-TOF/ Q-TRAP HPLC Trypsin digestion 1D-SDS Electrophoresis Phosphorylation data analysis 2-DE在膜蛋白分析的应用 新的表面活性剂的应用,提高膜蛋白的溶解性; 新方法,如采用Triton X-144, 或碱性Na2CO3预处理膜蛋白组分,分离内在膜蛋白的技术,有机溶剂抽提膜蛋白等; ? Eur. J. Biochem. 2000,267, 2871-2881 Molly等人用碱性Na2CO3预处理技术分离大肠杆菌内在膜蛋白,再用裂解液溶解后,2-DE分离鉴定了21种内在膜蛋白,占预测总内在膜蛋白的80%; 现常用预分级+窄pH胶的微制备技术进行分离:即将总蛋白组分成蛋白质组亚群,再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。??? 1-DE在膜蛋白分析的应用 非双向凝胶电泳技术的应用: 1)单
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