荧光蛋白表达.pptVIP

~~同志们 我觉得咱们因为是最后一个组讲，而且前几个组基本上讲的都是gfp~所以我是想把gfp少讲一些，大概的背景和主要的序列介绍一下就好~ 然后着重介绍一些rfp和yfp，不过这两个部分的介绍也很少~ 然后我主要是放图片，文字如果周三没法脱稿，就打印下来吧~ * 底图：绿色荧光蛋白的来源（水母） 左图：绿色荧光蛋白的形态 右图上：科学家在线形虫体内植入绿色荧光蛋白质 右图下：绿荧光水母——通过体内绿色荧光蛋白发光（是不是发现gfp的那个水母我就不知道了。。。） 来源：这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。 绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，负责发光的基团位于桶中央，因此，绿色荧光蛋白可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”。装在“桶”中的发光基团对蓝色光照特别敏感。当它受到蓝光照射时，会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。利用这一性质，生物学家们可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞，然后在蓝光照射下进行显微镜观察。原本黑暗或透明的视场马上变得星光点点——那是被标记了的活动目标。对生物活体样本的实时观察，在绿色荧光蛋白被发现和应用以前，是根本不可想象的。而这种彻底改变了生物学研究的蛋白质，最初是从一种广泛生活于太平洋海域的发光水母体内分离得到的。 * 2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）、美国科学家马丁·查尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖。 在诺贝尔奖新闻发布会的现场，发言人取出一支试管，置于蓝光灯之下，这支试管中的物质就发出了绿色荧光。 * 后一部分对于GFP的介绍都是拷贝别的组的~ 你们看要不自行修改一下吧~ * 不好意思这一部分也是直接复制孟玲她们组的~到时候再改改啦· * 黄色荧光蛋白（Yellow Fluorescent Protein ，YFP）可以看做绿色荧光蛋白的一种突变体，最初来源于维多利亚多管水母（ Aequorea victoria）。相对于绿色荧光蛋白，其荧光向红色光谱偏移，而这主要是由于蛋白203位苏氨酸变为酪氨酸。其最大激发波长为514 nm，最大发射波长为527 nm。 * * 应用 * 基本原理：聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（acrylamide）和N,N-亚甲基双丙烯酰胺（N,N-methylene bis acrylamide）经共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine,TEMED）和过硫酸铵（ammonium persulfate,AP）激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙烯酰胺，使多聚链交叉互联成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。 * * * * 此页是三种荧光蛋白的 设计引物~~~ * * * * * * * KD是啥意思呀？ * * * * pET-28a载体  pET-28a-c(+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时含有一个可以选择的C端His标签。pET28a载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat. No. 69337-3)的作用下终止蛋白翻译。 两种菌株差异 克隆宿主：E.coliDH5α缺少目的基因表达相关的酶， 不能够表达出目的基因，转入的载体在其中大量复制； 表达宿主：E.coliBL21（DE3）则可以表达出目的基因，即得到绿色、黄色、红色的荧光蛋白。 两种载体差异 克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。 表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆，但不具备表