动物细胞培养和表达制备药用蛋白我.ppt

第十节 动物细胞表达制备药用蛋白 动物细胞蛋白质可以解决蛋白质翻译后的糖基化、磷酸化和乙酰化等修饰性问题，这些是保持生物学活性，稳定性及抗原性的前提，这是原核表达系统所没有的。 转基因方法 哺乳动物细胞转染（接受外源基因）方法主要分物理、化学和生物方法，包括暂时转染和永久转染。 物理方法 主要是电穿孔法 化学方法 DEAE（二乙氨乙基）-葡聚糖法 磷酸钙-DNA共沉淀法 脂质体载体包埋法 生物学方法 主要是指病毒介导的基因转移，目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、DNA病毒载体等。 优点：宿主范围广，对受体细胞分裂周期要求不严，外源基因在载体上容易表达 动物转染（转基因）细胞筛选 遗传标记 编码产物 筛选药物 作用机理 APH- 氨基糖苷磷酸转移酶 G418 APH灭活G418 DHFR 二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤 DHFR变体抗氨甲喋呤 HPH- 潮霉素B磷酸转移酶 潮霉素B HPH灭活潮霉素B TK- 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 TK合成TMP HGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸 氨甲喋呤 HGPRT合成GMP 核糖转移酶 附：动物细胞培养物的污染及防止 按现代的观念，凡是混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应该视为污染。根据这一概念，组织培养污染物应包括： 微生物（真菌、细菌、病毒和支原体） 化学物质（影响细胞生存、非细胞所需的化学成分） 细胞（非同种的其他细胞）。 其中以微生物最为多见。另外，随着使用细胞种类增多，不同细胞交叉污染，尤其是Hela细胞的污染也时有发生，从而造成细胞不纯。 污染途径 1 空气：空气是微生物及尘埃颗粒传播的主要途径。因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内进行，工作时要带口罩，以免因讲话、咳嗽等使外界污染进入操作面，造成污染。 2 器材：各种培养器皿、器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染，另外需要对培养箱进行定期消毒，防止形成污染。 3 操作：实验操作无菌观念不强，培养两种细胞以上时，交叉使用吸管或培养液、瓶等有可能导致细胞交叉污染。 4 血清：有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染，变成了污染。 5 组织样本 污染对培养细胞的影响 培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。 细胞污染早期或污染程度较轻时，如果能及时去除污染物，部分细胞有可能恢复。 污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分类象减少，细胞变得粗糙，轮廓增强细胞浆出现颗粒；污染较严重，细胞增殖停止，分裂消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆、脱壁。 细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测 常见的污染细菌有大肠杆菌、假单孢菌、葡萄球菌等。 细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，污染情况用倒置显微镜观察不易判断。 检测：取10ml细胞悬液离心1000转5分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml，将细胞放培养箱培养。当污染细菌时，培养系统中产生大量细菌，几个小时后，增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效。 真菌污染对细胞的影响及污染物的检测 微生物污染中以真菌最多，真菌污染后易于发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞之间。 念珠菌和酵母菌卵圆形，散在细胞周边和细胞之间生长。真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞。抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。 支原体污染对细胞影响及污染物的检测 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题，是细胞培养最常见的、干扰试验结果的一种污染。 研究表明，95％以上是以下四种：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆支原体（A.laidlawii），为牛源性。 国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。 支原体污染细胞后，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。 支原体污染对细胞影响及污染物的检测 支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如β-内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。 对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环