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致病菌检验—— 霉菌和酵母菌检验 一、霉菌和酵母的测定 以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。 霉菌和酵母数的测定：GB4789.15-2010 食品检样经过处理，在一定条件下培养后，1g或1mL检样中所含的霉菌和酵母菌菌落数（粮食样品是指1g粮食表面的霉菌总数）。 霉菌和酵母菌计数技术 1、样品的稀释培养 （1）以无菌操作将检样25mL(或25g)放于含有225mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。 （2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌蒸馏水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。 （3）另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL灭菌吸管。 （4）根据标准要求或对污染情况的估计，选择3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。 及时将15mL～20mL 冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，观察并记录。 2、菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位CFU表示。 选取菌落数在10 CFU～150 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。 2、菌落计数 1）计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。 2）若所有平板上菌落数均大于150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 3）若所有平板上菌落数均小于10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 4）若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。 3、报告 取值原则同菌落总数。 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。 二、常见产毒霉菌的鉴定 1、菌落的观察 将纯培养物点植于察氏琼脂平板上。 方法是：将平板倒转，向上接种1点或3点，每菌种接种2个平板，倒置于25－28温箱中进行培养。当刚长出小菌落时，取出一个平皿，以无菌操作，用小刀将菌落连同培养基切下1cm×2cm的小块，置菌落一侧继续培养，于5－14d进行观察。 二、常见产毒霉菌的鉴定 2、斜面观察 将霉菌纯培养物划线接种（曲霉、青霉）或点种（镰刀菌和其他菌）于斜面，培养5－14d，观察菌落形态。同时还可以将菌种管置显微镜下用低倍镜直接观察孢子的形态和排列。 二、常见产毒霉菌的鉴定 3、制片 取载物片和乳酸－苯酚液1滴，用接种钩针取一小块霉菌培养物置于乳酸－苯酚液中，用两支分离针将培养物撕开成小块，然后加盖玻片。 4、镜检 观察霉菌的菌丝和孢子的形态，描述及检索表，确定菌种名称。