基因和体外重组和转化.pptVIP

重组过程中，需要考虑的因素： （1）连接效率高、易于筛选； （2）便于回收外源基因； （3）在载体的启动子控制之下，并置于正确的阅读框之中，以便表达。 碱性磷酸酶处理质粒载体 为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。 常用碱性磷酸酶 连接体系 连接反应中值得注意的几个问题 1. 载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。 2. 平末端连接在22℃保温4-16小时，粘性末端在22℃保温3小时，或16℃保温16小时。大多数连接反应用T4DNA连接酶，但大肠杆菌的DNA连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。 3. 载体和插入片段的纯度应较高，溶解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而不是TE，毕竟TE中含有离子，可能影响连接反应。 1972年，美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子。 1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。 美国总统国家科学奖 Stanley Cohen教授发明该专利时的笔记照片-重组DNA专利 由流动镶嵌模型发展而来的生物膜结构模型 黑膜试验 CaCl2法制备感受态细胞流程 １．将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16～20小时。 ２．挑取单菌落转入10ml LB培养基（100ml-胰蛋白胨1g，酵母提取液0.5g，NaCl 1g，dH2O）中，37 ℃ 振荡培养过夜。 ３．从中吸取1ml转入50ml LB培养基中37℃振荡培养， 测OD600达0.4～0.6。 ４．培养物在冰浴中放置10分钟。 ５．取1.5ml加入预冷的Eppendorf管中，于5000rpm下室温离心2--5分钟。 ６．弃上清，加入1ml用冰预冷的0.05M CaCl2 ，混匀，置冰上10分钟。 ７．5000rpm 4℃离心10分钟，弃上清，加100ul 0.05M CaCl2重悬，置冰浴备用或于4℃短期保存。 ８．若欲将制备的感受态细胞长期保存，将制备的细胞重悬于含有15％甘油的0.05M CaCl2 中，放入-80℃冰箱或液氮中冻存。。 转化-热激发 取制备好的感受态细胞，置于冰浴上； 向感受态细胞中加入连接产物（不超过转化体系的1/10体积），柔和混匀后冰浴上放置30min； 将连接体系放入42℃水浴中热激90sec；迅速转入冰浴2min； 加入0.8ml LB培养基，37℃振荡培养45min； 取适量培养物涂布于Amp+ LB固体培养基，放入37℃培养箱中培养。 转化示意图 1. 0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态； 2. 加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上； 3. 经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。 用氯化钙化学转化 原生质球 (Spheroplast) 指细胞壁未被全部去掉的细菌细胞，它呈圆球状，可以人为地通过溶菌酶或青霉素处理革兰氏阴性细菌而获得。 该类菌细胞壁肽聚糖虽被除去，但外壁层中脂多糖、脂蛋白仍然保留，外壁的结构尚存。所以，原生质球较之原生质体对外界环境具一定抗性，并能在普通培养基上生长。 二、重组DNA导入大肠杆菌 （1）转化（transformation) 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （2）转染（transfection) 大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （3）转导（transduction) 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。 每?gDNA转化成功的细菌克隆数。 3. 转化方法 2. 转化率 简单，但转化效率不高 （1）热休克法（heat shock） 转化效率高 （2）电转化法 10ng载体DNA 100?L感受态菌 On ice混合，静置10分钟 42oC 1分钟 加入1mL LB培养基 37℃摇1小时 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板