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第五章 其他功效成分 第一节 自由基清除剂种类和作用机理 自由基的概念及其对人体的影响 任何包含一个或多个未成对电子并能独立存在的原子或基团。 氢自由基、超氧阴离子、羟自由基、烷氧基、氢过氧基、单线态氧。 过氧化氢是活性氧，有高反应性，可促进自由基生成，称自由基关联物质。 氧的损伤 氧分子轨道有两个未成对电子，很易转变为自由基或活性氧。 氧化应激 生物体内氧化与抗氧化失去平衡。 氧化应激原因 营养不良造成膳食抗氧化剂耗竭；活性氧自由基产生过多。 自由基处于产生与清除的动态平衡 体内物质和能量的转化（氨基酸的氧化等）；维持在一个适当水平（破坏细胞结构）。 自由基引发并参与脂质过氧化作用。 改善膳食（减少脂肪、增加水果蔬菜和谷物），食物抗氧化剂的积累，延迟或预防疾病。 自由基清除剂的种类和作用机理 能清除体内自由基或能阻断自由基参与氧化反应的物质。 非酶类清除剂 抗氧化剂（VE、VC、胡萝卜素、还原型谷胱甘肽）。 酶类清除剂 抗氧化酶（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶）。 抗氧化酶 能清除活性氧的酶。 非酶类清除剂 抗氧化剂：食品和药物中的抗氧化成分； 自由基清除剂：能清除自由基实现抗氧化作用的物质； 自由基清除剂只有在足够浓度时才起作用； 清除剂只有在产生自由基的位置附近才能起作用； 清除剂与自由基反应后本身会成为新自由基，这个新自由基的毒性应小于原来的才能起防护作用。 超氧化物歧化酶 超氧化物歧化酶的基本特性及生理功 超氧化物歧化酶的组成和分类 Cu,Zn-SOD， 绿色； Mn-SOD，紫色； Fe-SOD，黄褐色。 超氧化物歧化酶的主要理特性 等电点pH4~6，偏酸性，酸性蛋白； 对热、pH和蛋白水解酶的稳定性好。 超氧化物歧化酶的物化特性和生理功能 延缓由于自由基侵害引起的衰老现象 自由基引起机体衰老的机制： 生物大分子的交联聚合和脂褐素积累； 器官组织细胞的死亡和癌变； 免疫力降低。 治疗由自由基损伤而诱发的疾病 消除肌肉疲劳 提高人体的抵抗力 超氧化物歧化酶的制备 原料 动物：牛血、猪血、马血、兔血、蛋黄、 鸭血、猪肝、牛乳等； 植物：剌梨、大蒜、小白菜、饭豆等； 微生物：酵母菌。 沉淀法 热稳定性好，温度低于80℃，短时间热处理酶活力损失不大，一般杂蛋白在高于55℃易变性沉淀。 酶蛋白在等电点时，溶液中的静电荷为零，酶蛋白的溶解度最小而沉淀下来。 粗酶溶液中加入一些弱极性有机溶剂（丙酮），改变溶液的介电常数，使不同种类的蛋白质的溶解度产生不同程度的下降； 可以把超氧化物歧化酶和其他的杂蛋白分开。 离子交换层析法 离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行。 等电点在4~6之间，pH7.0时带负电，能被阴离子交换剂吸附， 根据离子交换剂对蛋白质结合力差异，用具有一定离子强度流动相进行洗脱，就可和其他杂蛋白分开。经透析，冷冻干燥。 盐析法和金属螯合亲和层析法 盐的浓度增高到一定数值时，水活度降低； 蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏； 引起蛋白质分子间相互聚集从溶液中析出。 一定浓度范围的盐浓度(如1%~25%饱和度硫酸铵)，使部分杂质呈“盐析”(沉淀)状态。 有效成分呈“盐溶”(溶解)状态； 离心分离得上清液，选择一定浓度范围的盐浓度(如25%~60%饱和度的盐溶液)； 使SOD呈盐析状态，另一部分杂质呈盐溶状态； 离心收集的沉淀为初步分离制备的SOD。 亲和层析 把对SOD具有识别能力的配体Cu2+以共价键的方式固化到含有活化基团基质如壳聚糖上，然后装入层析柱； SOD粗酶液通过该柱量，由于静电引力，结构互补效应等作用使其被吸附，而无亲和力或非特异吸附的物质被起始缓冲液洗涤出来。 改变起始缓冲液的pH，或增加离子强度，或加入抑制剂等； 把SOD解离下来。 这一操作可把SOD和杂蛋白分开。 酵母发酵法 酵母菌种进行摇瓶培养； 离心收集菌体，悬浮于磷酸钾缓冲液中，超声波破壁，离心除去残渣，得粗酶提取液； 经盐析和柱层析得酵母SOD。 超氧化物歧化酶的修修饰工艺 硬脂酸修饰法 硬脂酸活化成硬脂酰氯； 在一定条件下对SOD分子中的赖氨酸ε–氨基进行修饰，提高了其稳定性。 糖酯修饰法 一定条件下，将葡萄糖酸内酯与超氧化物歧化酶上赖氨酸的ε–氨基结合，提高其稳定性。 聚乙二醇修饰法 一定条件下，经活化的聚乙二醇对SOD非活性部位上赖氨酸的ε–氨基进行修饰，增强SOD对环境的稳定性。 超氧化物歧化酶的应用 ?SOD作为药物在临床上被广泛应用，研究证明经口摄入SOD是有效的，为SOD应用于功能食品的开发提供理论依据。