吡啶诱导白毛真菌三孢布拉氏霉菌生物合成番茄红素的调节E.P.docVIP

PAGE PAGE 7 吡啶诱导白毛真菌三孢布拉氏霉菌生物合成番茄红素的调节E.P.Feofilova,V.M.Tereshina,and A.S.Memorskaya 微生物研究所，俄罗斯科学学会，pr.60-letlya Oktyabrya 7,k,2,Moscow, 117811 Russia,1994年10月8号 摘要：吡啶诱导刺激三孢布拉氏霉菌生物合成番茄红素。6-甲基-2氨基吡啶被证明是最有效的刺激剂。利用放线菌和放线素是基因调节从头合成的刺激反应器。6-甲基-2氨基吡啶在三孢布拉氏霉菌合成类胡萝卜素中的作用是抑制环化酶和一些脱氢酶，刺激类胡萝卜素前体和一种抗氧化剂的合成。6-甲基-3-乙基-3-羟基吡啶是一种抗氧化剂，在加入6-甲基-2氨基吡啶的条件下，产生一种作用刺激生物合成番茄红素。提出了三孢布拉氏菌合成番茄红素中可能的生物作用。 在现代生物工艺学中，被称为化学生物调节器的特殊复合物的利用是获得次生代谢物的一种有效方法，例如：β-紫罗酮，三孢酸和VA通过白毛真菌三孢布拉氏菌增加β-胡萝卜素产量10-15倍。 前几年，另一种类胡萝卜素—番茄红素，由于它好的抗氧化作用，在生物工艺学和药学中吸引了特殊的关注。它还被用做天然染料，把食品染色成红色和桃红色。 番茄红素的化学合成与微生物合成相比，在经济上较差，工业复合过程较好。三烃基铵氯化物和吡啶这些生物调节剂在植物、真菌和细胞中的使用抑制胡萝卜素的生物合成，增强了番茄红素的产率。相似研究表明，β-胡萝卜素的超级生产物，即三孢布拉氏霉菌，在工业上是用来生产β-胡萝卜素的。 生物调节剂的使用使番茄红素的产量增至1.0-1.5g/l（培养基）成为可能，但是，生物调节剂的作用机理还不明确。阻止了生物工程的更进一步发展。由于这个原因，我们工作的目的是寻找新的生物合成番茄红素的刺激剂，并阐明该合成过程和刺激剂的化学结构之间的关系，以及寻找一个新的方法来阐明三孢布拉氏霉菌在生物合成番茄红素中的刺激作用的机理。 材料与方法 这项实验中使用了三孢布拉氏霉菌菌株（+）-A-732和（-）-A-732（由A.I.Kiseleva提供）。该菌丝体在添加了2%的葵花子油的玉米-大豆培养基，并在26-29。C，摇床（230-240r/min）作用下生长.该真菌在含有50ml该培养基的250ml容量瓶中生长。（+）/（-）孢子比例为1：15的孢子悬液被用作接种体。 β-胡萝卜素和番茄红素的含量是通过Unicam SP 1800分光光度计测得，或者使用丙酮提取真菌生物量，再用正己烷提取类胡萝卜素之后使用SF-56 LOMO分光光度计测量；根据Brockman在[4]中的描述，在Al4+培养皿中用薄层色谱法测量。后者常用于测定ζ-胡萝卜素、八氢番茄红素、六氢番茄红素、γ-胡萝卜素和链孢红素的含量；在[4]中出项的E值是用于计算这些多烃的含量的。 三孢布拉氏霉菌菌丝体的碳水化合物的分析 在沸水中煮二十分钟后，提取四次碳水化合物。使用Dowex-50W(H+)和Dowex-1（醋酸盐形式），通过离子交换色谱法移出蛋白质，然后将纯化的蛋白质样本低压冻干。碳水化合物然后转化为三甲基甲硅烷衍生物，用5%的SE-30缓和的红色硅藻色谱载体装成的两米玻璃柱,使用气-液色谱法验证，用3700-模式气-液色谱和从170到270。C温度梯度。肌糖，葡萄糖，海藻糖，甘露糖，蔗糖，棉子糖被作为测定标准。 吡啶诱导剂和二氮氯圜的合成方法在[3]中描述过。抗氧化剂（亚诺抗氧化添加剂、6-已氧基二氢2，2，4-三甲基喹啉、VE、6-甲基-3-已基-3-羟基吡啶）由E.B..Burlakova和L.A.Vakulova提供。每个实验做了三到四次。表中的数据代表了实验结果的平均值。 结果和讨论 首先，我们研究了向生物合成番茄红素的发酵培养皿中加入刺激剂的最佳时间。在以前的实验中，三孢布拉氏霉菌的生长和在已用培养基中生物合成番茄红素的动力学已经研究。三孢布拉氏霉菌的生物量在培养的第46-53h停止。到这个时间，菌丝体的合成量已经大约为β-胡萝卜素在繁殖期最后合成量的一半。β-胡萝卜素最强烈的合成期为第二到第三天，并且生长过程强度有一个大的增长。 在含有2%的葵花子油的玉米-大豆培养基中三孢布拉氏霉菌和β-胡萝卜素数量的动态 （1）生物量；（2）β-胡萝卜素 根据在[4，6]中的数据，生物合成番茄红素的刺激剂是2-氨基吡啶。这种复合物在生长的29h，46h，53h，77h加入到三孢布拉氏霉菌培养基中，阐明加入刺激剂的最佳时间。 表1 三孢布拉氏霉菌生物合成番茄红素中加入2-氨基吡啶的时间的作用 注：C—标准；E—试验；下标代表2-氨基吡啶的加入时间；所有的试验都做96h。 在培养的第53h向发酵