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中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群SN?0169—92 和大肠杆菌检验方法代替?ZB?X09?002一88 Method?for?examination?of?coliform,?fecal?coliform and?escherichia?coli?in?food?for?export ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━ 1?主题内容与适用范围 本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。 本标准适用于出口食品的检验。 2?设备和材料 2.1?吸管:?1mL,具0.1mL刻度;5mL和10mL,具1mL刻度。 2.2?水浴箱:44.5±0.5℃。 2.3?培养箱:36±1℃,44.5±0.5℃。 2.4?冰箱:?0~5℃和-15~-20℃。 2.5?均质器。 2.6?乳钵和研棒。 2.7?平皿:直径90mm。 2.8?天平:感量0.1g。 2.9?显微镜。 2.10?稀释瓶:100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。 2.11?玻璃珠:直径约5mm。 2.12?菌落计数器。 3?培养基及试剂 3.1?月桂基硫酸盐胰蛋白(月示(LST肉汤。 3.2?煌绿乳糖胆盐(BGLB肉汤。 3.3?EC?肉汤。 3.4?伊红美蓝琼脂(EMB。 3.5?营养琼脂斜面。 3.6?色氨酸肉汤。 3.7?MR-VP培养基。 3.8?Korser氏枸椽酸盐肉汤。 3.9?结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA。 3.10?Butterfield?氏磷酸盐缓冲稀释液。 3.11?生理盐水。 3.12?革兰氏染色液。 3.13?Kovacs氏靛基质试剂。 3.14?甲基红指示剂。 3.15?Voges-pros?kauer(V-P试剂。 4?样品制备 4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。若不 能 及时检验,应将冷冻样品置于- 15℃保存;非冷冻而易腐的食品,应置于4℃冰箱保存。检 验前冷冻样品可于2~5℃?18h内解冻,或在45℃以下15min内解冻。 4.2?不同食品样品匀液的制备 4.2.1?液体食品 以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量 的玻璃珠, 以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇,制成1:10的样品匀液。 4.2.2?固体和半固体食品 以无菌操作取25?g样品,放入装有225?mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质1~2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替。 4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递 增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**- 4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程 不得超过15min。 5?大肠菌群的测定 5.1?大肠菌群MPN值的测定 5.1.1 对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月 桂基硫酸盐胰蛋白(月示(LST肉汤,每管接种1mL。 5.1.2?将接种管置于36±1℃培养48±2h。 5.1.3 观察试管的产气情况:检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST 肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性;如有产气者,则进 一 步作证实试验。 5.2?大肠菌群的证实试验 5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB肉汤管中。 5.2.2?置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。 5.2.3?记录所有BGLB肉汤管的产气管数。 5.2.4?结果报告:按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B (补充件]报告每克(毫升样品中大肠菌群的MPN值。 6?粪大肠菌群测定 6.1 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中 。 6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养24±2h。水浴箱 的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃ 不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。 6.3 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性;不产气管为粪大肠菌群 试验阴性。 6.4 结果报告:按产气管数,查MPN表报告每克(毫升样品中粪大肠菌群的MPN值。 7?大肠杆菌测定 7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB 平板,36±1℃培养24±2h。 7.2?检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。 7.3 如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落;