第五章细胞生物学检测技术.pptVIP

第五章 细胞生物学检测技术;内容;第一节 细胞形态观察技术;细胞是生物体的基本结构单位。构成生物机体的细胞是多种多样，且体型微小，要对细胞进行研究，需借助显微镜的成像及放大原理，在显微镜下，才能观察到细胞的基本形态结构。通过观察形态可以检测药物对细胞的作用。 细胞可直接观察、染色观察；可用光镜、荧光显微镜法和电镜法等观察。 常见的观察方法有： ;一、显微镜直接观察 显微镜是观察细胞形态结构的主要工具，按照光源不同，分为光学显微镜（可见光/紫外光）和电子显微镜（电子束）。 （一）、光学显微镜 1、相差显微镜（PCM） 1953年获得诺贝尔物理奖，相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光（直射光和衍射光）的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 应用：观察未经染色的标本和活细胞。 ;;;操作步骤： 1、打开光源 调整相差聚光器的位置和物镜放大倍数。目镜换成普通望远镜，使视野中2个大小一样的光环重合。 2、观察瓶皿准备 表面搽干净，放入目镜台。 3、调光 调节光强度、光轴，使视野照明均匀。 4、调焦与摄影 使视野图像最清晰，拍照。 观察时以观察目镜为准，照相以摄影目镜为准。;\\\\\\\\\;2、荧光显微镜 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 ;;;3、 激光共聚焦扫描显微镜（LSC显微镜） 可改变观察的焦平面，因而能进行“光学切片”，观察较厚样品的内部结构。将改变焦点获得的一系列细胞不同平面上的图像叠加后，可重构出样品的三维结构。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 ;;;4、 暗视野显微镜 使用特殊的照明方法，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见??小至 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。 应用：观察未经染色的活体或胶体粒子。 ;;5、偏光显微镜 是研究具双折射性物质的主要仪器，如纤维、染色体和透明矿物等。与一般的生物显微镜相比，最主要的区别是有两个偏光镜。其中，一个安装在载物台之下，称下偏光，另一个安装在载物台之上的镜筒中，称上偏光。在偏光显微镜中，上偏光的振动方向是固定的，而下偏光的振动方向是可以调节的。一般来说，两个偏光的振动方向是相互垂直的。 ;偏光显微镜; 镜臂、镜筒、镜座、 反光镜、下偏光镜、 锁光圈、聚光镜、载物台、 物镜、目镜、 上偏光镜、勃氏镜、 粗调螺丝、细调螺丝、 附件等 ;6、 微分干涉差显微镜（DIC显微镜） 1952年，日本的Nomarski发明。能显示细胞结构的三维立体投影影像，立体感强，用于研究活细胞中较大的细胞器，与录像设备结合，可观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。; 尼康E800荧光DIC显微镜 ; DIC显微镜下的硅藻 ;7、倒置显微镜 inverse microscope ;8、当代显微镜的发展趋势;（二）、活细胞染色方法 染色为便于观察 1、中性红染色 使用0.01%浓度，高压灭菌后暗处保存。 活细胞——红色；死细胞无色。 2、结晶紫染色 使用0.1%浓度，对死活细胞均着色。可用于总细胞计数。;3、台盼蓝染色法;;二、细胞固定观察法;（一）细胞固定的基本方法 无论什么方法培养的细胞，都能固定、染色。 其中以盖片培养固定最常见。操作方法： 1、培养皿/板的孔里放盖玻片。 2、加一定浓度的培养基和细胞，细胞长满玻片后取出，洗净。 3、悬浮培养的细胞，先离心收集细胞，洗净，涂片。 4、固定 固定液有甲醇-醋酸，甲醛-酒精-醋酸，Carnoy（卡偌氏）液等多种。固定15min即可染色。 ;（二）、染色 1、HE染色 苏木素（Hematoxylin）－伊红（Eosin）染色法，简称HE染色法。 HE染色法采用两种染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别于细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折光率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像。该染色过程既有化学反应，又有物理作用参与。从化学反应看，组织细胞内含有酸性物质和碱性物质，细胞的酸性物质与碱性染料的阳离子结合，而细胞核的碱性物质与酸性染料的阴离子结合，使其中酸性细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，而碱性的胞浆被酸性染料伊红染成红色。其结果胞核呈蓝色，胞浆呈红色。从物理现象看，主要有吸附、吸收之说。HE染色提供良好的核浆对比染色，是细胞化学染色最常用的一种方法。;试