讲课—血红蛋白的提取和分离课件.pptVIP

谢谢大家 * * * 课题3　 血红蛋白的提取和分离 课标领航 1．概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理。 2．能根据凝胶色谱过程中的现象和结果，评价实验操作的过程是否规范，分析实验结果。 3．尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本过程和方法。 【重点】　凝胶色谱法、电泳法基本原理。 【难点】　实验操作的过程及分析。 基础自主梳理 一、凝胶色谱法 1．概念：也称作分配色谱法，是根据__________质量的大小分离蛋白质的有效方法。 2．原理 (1)由微小的多孔球体构成的凝胶，内部有许多贯穿的通道。 相对分子 蛋白质的物理性质：分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等 (2)由相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量_____的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在________移动，路程较短，移动速度较快，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离。 较小 凝胶外部 相对分子质量大 相对分子质量小 直径大小 大于凝胶颗粒空隙直径 小于凝胶颗粒空隙直径 运动方式 垂直向下运动 无规则的扩散运动 运动速度 较快 较慢 运动路程 较短 较长 洗脱次序 先从凝胶柱中洗脱出来 后从凝柱中洗脱出来 蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析 2．配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的________就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。 三、电泳 1．概念：指________在电场的作用下发生迁移的过程。 2．原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷_____的电极移动。 使用比例 带电粒子 相反 二、缓冲溶液 1．作用：在一定范围内，抵制外界的_______对溶液pH的影响，维持pH基本不变。 酸和碱 3．作用：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、____的不同，使带电分子产生不同的____________，从而实现样品中各种分子的分离。 4．方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 形状 迁移速度 四、 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速率决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状不同 在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，使其迁移速率完全取决于分子的大小 四、实验操作 1．样品处理：通过___________、_______________、分离血红蛋白溶液等操作收集血红蛋白溶液。 (1)红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。分离时采取低速短时间离心，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 (2)血红蛋白的释放：在蒸馏水和____的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液：把搅拌好的混合液离心后, 分为四层：1.无色透明的甲苯层2.白色薄层固体(脂类物质)3.红色透明液体(血红蛋白的水溶液)4.其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透明液体。 甲苯 血红蛋白的释放 红细胞的洗涤 2．粗分离：即透析 (1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入一定量适宜浓度的___________中，透析12 h. (2)目的：将样品中分子较小的杂质除去。 (3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。 磷酸缓冲液 3．纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下： (1)凝胶色谱柱的制作。 (2)凝胶色谱柱的装填 ①材料：本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。 ②方法：凝胶用_______充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有______存在；不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。 (3)样品的加入和洗脱 ①a.准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与________平齐，关闭出口。 蒸馏水 气泡 凝胶面 b．加样：用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。 c．加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内. ②洗脱：加入____________，打开下端出口，进行洗脱。 4．纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。 五、操作提示 1．红细胞的洗涤：洗涤次数、________与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白：离心速度过高和时间过长会使_______等一同沉淀，达不到分离效果。 磷酸缓冲液 离心速度 白细胞 2．色谱柱填料