实验三、质粒dna的酶切.pptVIP

实验三、质粒DNA的限制性酶切鉴定、割胶回收与纯化（10学时） 1. 内切酶的作用原理 2. 常用的酶切体系及作用条 3. 影响酶切的因素 4. 电泳检测 5. 胶回收试剂盒的操作步骤及注意事项 概述 没有核酸限制性内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展，在基因工程和分子生物学中，没有一种酶像限制性内切酶那样举足轻重和应用广泛。 限制性内切酶均来源于原核生物，它们的功能类似高等动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的入侵。 核酸限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA的酶，即是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。限制性内切酶作用于磷酸二酯键，使双链DNA中两条单链上的3’,5’-磷酸二酯键断裂，产生的DNA片段5’端为P,3’端为OH,是基因工程的第一步获取目的基因所必须用的酶。 限制性内切酶可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)DNA作用，且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的DNA，不产生特异片段，故在基因重组中没有应用价值。而Ⅲ类酶在特异识别位点上切割DNA分子，其切割位点在识别位点以外（很远的位点），对基因工程的意义不大。 Ⅱ类酶由两种酶组成: 一种就是通常指的限制性内切酶，它识别并切割某一特异的DNA的核苷酸序列，产生特异的DNA片段；另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列,使A（嘌呤）甲基化。Ⅱ类酶中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础，绝大多数能识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5’- G↓AATTC-3’)，有少数酶识别更长的序列或简并序列。 Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端（ 3 ’突出和5 ’突出的单链末端）的DNA片段称粘性未端，如EcoRⅠ、PstⅠ 切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5…G↓AATTC…3 →5… G AATTC…3 3…CTTAA↑G …5 →3… CTTAA G…5 ’ SmaⅠ:5 ’ -CCC↓GGG-3’ →5…CCC GGG..3’ 3 ’ -GGG↓CCC-5’ →3…GGG CCC..5’ Ⅱ类限制性内切酶可分四类： 1.异源同工酶：是不同来源分离得来的不同酶，它们有相同的识别序列，切割方式可以相同，也可不同。如HpaⅡ与MspI,它们识别和切割序列相同，但MspI还可识别切割已甲基化的序列，如GG mCC。SmaI 和XmaI识别序列相同，但切割位点和方式不同，前者产生平末端，后者产生5‘粘性末端。 2.Subset酶：识别与切割序列相互有关的酶互称Subset酶，如SmaI的6核苷酸序列中包含HpaⅡ的4核苷酸序列。Subset酶之间可以代替使用，2个Subset酶消化的DNA片段，可以相互连接，连接后的重组DNA分子，可以被其中一种酶识别，或均不能识别。 3.远距离裂解酶：识别位点与切割位点不一致，它们在某一核苷酸区域与识别序列结合，然后滑行到识别序列以外的另一个位点进行切割，一般滑行10个碱基左右。在基因工程中有一定的应用价值。 4.可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的，且其识别序列一般大于6个碱基，如BglⅠ识别GCC(N5)GGC 11个序列，其中5个是可变的。 在适当的反应条件下（包括温度、pH、离子强度等），1小时内完全酶解1ug特定的DNA底物所需要的限制性内切酶的量，定义为1个活性单位（1U)。目前市场上的几乎所有的内切酶，均以λ噬菌体DNA作为底物测定其活性单位。 限制性内切酶对于DNA底物的酶解是否完全与正确，直接关系到DNA连接、基因克隆分子筛选和鉴定等实验结果。而酶切体系的建立是其中的一个关键步骤，它所涉及的各种因素都必须引起足够的注意。 大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的灭菌吸管头,DNA要尽量纯，有一定的纯度。 DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性： 1、DNA纯度，在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。2、核酸内切限制酶的缓冲液，核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋