动物毒理学实验二 小鼠骨髓细胞微核试验.ppt

实验二小鼠骨髓细胞微核试验 2 实验原理 微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。 通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（PCE）的微核出现率，间接反应骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试药物是否具有致突变作用,主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成 3 实验材料 3.1 器材 解剖器械，显微镜，载玻片等。 3.2 试剂 甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、Giemsa储备液、pH 6.8磷酸盐缓冲液、小牛血清、生理盐水 3.3 药物 环磷酰胺 3.4 动物 小鼠7-12周龄，体重20-30g， 雌雄各半。 4 操作步骤 4.1 给药 环磷酰胺生理盐水溶液按50mg/kg剂量腹腔注射2次，间隔24h。 空白对照：生理盐水 4.2 骨髓液的制备和涂片 试验动物第二次染毒6小时后用颈椎脱臼或麻醉法将其处死，取胸骨，擦净血污，剔去肌肉。 在洁净的玻片滴小牛血清1滴，剪去骨骺，用止血钳将骨髓挤到血清中，混匀，推片，干燥。 4 操作步骤 4.3 固定 将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇液固定5-10min，取出，晾干。不能及时染色的涂片也应固定好保存。 4 操作步骤 4.4 染色 将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa染液(Giemsa储备液1份+pH6.8的磷酸盐缓冲液9份) 染色10-15min，冲洗，晾干。 1/15mol/L磷酸盐缓冲液(PH6.8)　磷酸二氢钾(KH2PO4)　　　　　4.50g　磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)　 11.81g　加蒸馏水至　　　　　　　　 1000mL 4 操作步骤 嗜多染红细胞（PCE）呈灰蓝色，正染红细胞（NCE） 呈粉红色。典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐， 嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。 4.5 观察计数 低倍镜下观察，选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，再在油镜下观察计数。 计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计数至少200个细胞（PCE+NCE≥200个）中PCE与NCE的比值。 4 操作步骤 MN NCE 5 结果记录 细胞 总数 微核 细胞数 微核率（‰） PCE数 NCE数 PCE/ NCE 空白组 染毒组 表 微核率统计 嗜多染红细胞微核率=有微核的嗜多染红细胞总数/检查嗜多染红细胞数×1000‰ 正常小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率为千分之五以下，超过千分之五为异常 。 6 结果分析与评价 本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。 PCE/NCE为评价细胞毒性的指标，受试组PCE/NCE值与阴性对照组比较有统计学意义表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。 正常PCE/NCE约为1（正常范围0.6-1.2），如比值小于0.1，表示PCE形成受到严重抑制；如比值小于0.05，表示受试物剂量过大，实验结果不可靠。 遗传损伤类型：基因突变、染色体畸变、染色体分离异常 在化学物质中，有很多能引起染色体的异常。染色体是遗传物质的载体并含有生物体全部的遗传信息，染色体遗传信息的异常可不同程度地影响生物机体的生存。轻者突变，重者死亡。同样，对人类就会引起各种疾病和损害。 化学物质能否诱发染色体异常?目前有许多种评价方法。但最常用的是：直接观察染色体异常(染色体中期相分析，chromosomal analysis，简称cA)和检测由于染色体丢失或断片形成而出现的微核(微核试验，micronucleus test，简称MNT)。MNT是公认的检测染色体异常的简便方法。特别是应用小鼠骨髓红细胞微核(micronuclei，简称MN)检测方法，目前已成为一种能获得大量客观数据的化学物质遗传毒性评价体系。 微核的出现率与染色体畸变率之间有明显的相关性，微核试验用于检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂。 微核可出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别，由于红细胞在成熟前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，因此，通常计数PCE细胞中的微核数。 PCE（polychromatic erythrocyte）指嗜多染红细胞， NCE（normochromatic erythrocyte）指正染红细胞。 PCE指晚幼红细胞最后一次分裂时，排出主核而未成熟为NCE前的细胞。PCE的主核已被排出，因胞质内含有核糖体，染色后呈灰蓝色（天青），NCE的核糖体已消失。