临床免疫学—实验-两对半的检测.ppt

ELISA检测“乙肝二对半”  (Enzyme linked immunosorbent Assay ELISA)   临床免疫学检验教研室 　 ELISA的概念 酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 酶联：抗原或抗体的酶标记。 免疫：以抗原抗体特异性反应为基础。 吸附：抗原或抗体包被于固相载体表面。 在固相载体表面实现抗原抗体的反应，通过酶标记的手段，酶催化底 物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色的深浅与标本中的 抗原或抗体的量直接相关。  ELISA技术特点 具有良好的灵敏度和特异性，能满足临床需要，应用广泛。 操作简单、无需昂贵的仪器投入，价格便宜。 对环境几乎没有污染。 ELISA技术的应用 检测抗原的方法： 检测抗体的方法： 双抗体夹心法 竞争法 双抗原夹心法 间接法 竞争法 捕获法 实验目的 全面掌握ELISA法检测“乙肝二对半” 的原理、操作过程及注意事项。 熟悉检测“二对半”的临床意义。 什么是“乙肝二对半”？ “乙肝两对半”是指：乙肝表面抗原（HBsAg）、表面抗体（HBsAb）、e抗原（ HBeAg ）、e抗体（HBeAb）、核心抗体（HBcAb） HBsAg本身不具有传染性，只具有抗原性 保护性抗体： HBsAb 传染性指标： HBeAg ， HBcAg HBeAb， HBcAb不是保护性抗体，而是反映曾被HBV感染的重要指标。 为什么不检测核心抗原（HBcAg） HBcAg主要位于病毒颗粒中，只有少数游离。 机体免疫系统对HBcAg很敏感，易产生高滴度的HBcAb,与HBcAg形成免疫复合物。 “乙肝二对半”的检测原理 HBsAg：双抗体夹心法（两步法：消除钩状效应） HBsAb：双抗原夹心法 HBeAg：双抗体夹心法 HBeAb：中和竞争法(待测样本的HBeAb与固相抗体竞争结合中和抗原HBeAg) HBcAb：竞争法 试剂盒组成 包被反应条：固相的抗原或抗体 酶结合物：酶标记的抗原或抗体 显色剂：分A、B二瓶 终止液 对照：阳性对照，阴性对照 浓缩洗涤液 中和试剂（只有检测HBeAb的试剂盒才有） 实验准备 配制洗涤液：用蒸馏水按1：25稀释浓缩洗涤液。 为节省试验时间，除检测核心抗体（HBcAb）组外，其余组可在加样后的温育时间中才配制洗涤液。 实验操作 1、加样：第一、二孔为阴、阳对照孔，分别加入阴、阳对照50ul。其余各孔为样品孔，各加入待测标本50ul（检测HBcAb 时，待测标本需用稀释后的洗涤液做1：30稀释）。 2、加中和试剂（只有检测HBeAb时才需要）：每孔50ul 3、加酶结合物：每孔50ul 4、温育：封板→充分混匀后置37°C水浴30分钟 5、洗涤：弃去反应条孔内液体，用洗涤液注满每孔，放置或振荡1分钟，弃去拍干→反复5次（注意：最后一次一定要拍干） 6、显色：每孔先加显色剂A 50ul，再加显色剂B 50ul，混匀后置37°C水浴10分钟 7、中止显色：每孔加入中止液50ul 8、判断结果： ①目测法： 颜色 结果 透明无色 阴性 黄色 阳性 HBsAg， HBsAb， HBeAg HBeAb ， HBcAb 颜色 结果 黄色 阴性 透明无色 阳性 ②比色法：波长450nm读取各孔OD值 HBsAg， HBsAb， HBeAg 样品OD值/阴性对照OD值≥2.1 HBeAb ， HBcAb 阴性对照OD值/样品OD值≥2.1 （建议双波长比色（450/630nm）） 阳性 阳性 ELISA的注意事项 标本：内源性和外源性因素 试剂：试剂质量、批号、是否失效、平衡、摇匀 加样：不可太快，避免加在上部和产生气泡。 加试剂时不可重复加和漏加，或加在两孔之间。 温育：温度、时间、湿度、封片 洗板：手工或仪器 比色：建议双波长比色。 结果判定：反应终止后10分钟内 质量控制：内对照、室内质控、室间质评等 表面抗原阳性结果建议复查；灰区标本和矛盾结果建议复查 试剂盒应视为有传染性物质。 常见的检测结果模式（临床意义） 模式 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb 临床意义 1 + - + - + ①急性乙肝 ②慢性乙肝 ③病毒复制活跃，传染性强 2 + - - - + ①急性HBV感染②慢性HBsAg携带者③传染性弱 3 + - - + + ①