第8章环境微生物分离与鉴定技术.pptVIP

* 第八章 环境微生物的分离与鉴定技术 微生物纯培养的分离方法 微生物分类鉴定的经典方法 微生物的快速鉴定技术 API细菌数值鉴定系统 Enterotube系统 微生物的现代分类检测技术 DNA碱基组成(G+C)mol%分析 Biolog方法鉴定环境微生物群落技术 16S rRNA序列分析技术 核酸杂交技术 DNA芯片技术 DNA指纹图谱技术 一、微生物纯培养的分离方法 固体平板分离纯培养 稀释平板法 平板划线法 单细胞分离法 菌丝尖端分离法 液体培养基分离纯培养 利用选择培养基分离 二、微生物分类鉴定的经典方法 指长期以来在常规鉴定中普遍采用的一些关于形态、生理、生化、生态、生活史和血清学反应等指标的鉴定方法。 微生物分类鉴定的依据： 形态特征 个体形态特征 培养特征 生理生化特征 常用的生化反应：糖发酵试验、VP试验、甲基红试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验、硫化氢试验、三糖铁(TSI)琼脂试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、氧化酶试验、过氧化氢酶试验、尿素酶试验等 二、微生物分类鉴定的经典方法 鉴定方法： 一般先根据形态特征鉴别其属于哪一大类(细菌、放线菌、酵母菌或霉菌) 再根据生理生化特征、生态特征、免疫特征和遗传特征等，借助于检索表或鉴定手册来依次确定是属于哪个目、科、属、种 对于不同的微生物有不同的重点鉴定指标 三、微生物的快速鉴定技术 API细菌数值鉴定系统(简易诊检技术、数码分类鉴定法) ADH ODC H2S TDA VP GLU INO RHA MEL ARA ONPG LDC CIT URE IND GEL MAN SOR SAC AMY 三、微生物的快速鉴定技术 Enterotube系统 美国Roche公司生产的Enterotube系统 Biolog法 Biolog测定原理： 微孔板，每板含有96个孔，其中95个孔中加入了95种单一碳源和四唑染料，另外一个未加碳源的孔中加水为对照，环境微生物接种至孔中，孔中一旦有电子转移，四唑染料就会变为紫色，颜色的深浅可以反映环境微生物对碳源的利用程度 该方法由美国BIOLOG公司于1989年开发成功，至今已能鉴定包括细菌、酵母菌和霉菌在内的2000多种病原微生物和环境微生物。 三、微生物的快速鉴定技术 四、微生物的现代分类检测技术 Biolog法 Biolog系统组成： 96个孔微孔板 读数器：读取一波长下小孔内吸光度及变化 微机系统 ：与读数器相连，自动完成数据采集、传输、存贮与分析 方法操作 平板选择 样品制备 加样 培育与读数 数据分析 四、微生物的现代分类检测技术 DNA(G+C)mol%值的测定 DNA(G+C)mol%值是微生物(除少数以RNA为遗传物质的病毒)的一个基本遗传特征，对特定微生物来说，(G+C)mol%是恒定的。 (G+C)mol%=(G+C)(mol)/(A+T+G+C)(mol)×100% (G+C)mol%的变化范围较广，原核生物为20-80，真核生物为30-60。 完全不同的微生物可能有相近的(G+C)mol%，但(G+C)mol%有明显差异的微生物肯定不会属于同一个种。 一般认为，种内菌株间(G+C)mol%相差不超过4%，属内菌株间相差不超过10%，相差低于2%时没有分类学意义 四、微生物的现代分类检测技术 DNA(G+C)mol%值的测定 DNA(G+C)mol%值可所用测定方法的不同和测定误差等而有差异 该方法操作简单，但分率力不高 (G+C)mol%的测定方法 热变性温度测定法(Tm法) 纸层析法 高效液相色谱法 浮力密度法 四、微生物的现代分类检测技术 核酸杂交技术 核酸杂交是指具有一定互补序列的两条核酸单链在液相或固相体系中按碱基互补配对原则缔结成异质双链的过程 DNA-DNA同源性分析 DNA-rRNA同源性分析 杂交方法 固相杂交法：一是待测菌的DNA或RNA，二是用于检测的已知序列DNA或片段，即探针 四、微生物的现代分类检测技术 DNA芯片技术 DNA芯片技术是指将多达成千上万种的探针分子按照特定的排列方式固定在固相载体(多数采用玻片)上，组成密集的微点阵或阵列，利用核酸杂交原理，用已知序列的DNA分子，按照碱基互补配对的原则，与标记的特异性单链DNA或RNA分子杂交形成双链，通过检测杂交信号的强弱来判断样品中靶分子的数量，实现核酸序列的分子识别。 DNA芯片技术的最大优势是可以同时、快捷、准确地分析数