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RS/TN/ZL-004 分光光度法测定纤维素酶酶活 版号/修改：A/0 共 4 页 第 1 页  分光光度法测定纤维素酶酶活 适用范围 本方法适用于纤维素酶酶活的测定。 测定原理 纤维素酶在一定温度与 pH 条件下，水解纤维素分子中糖苷键，生产纤维素寡糖、纤维二糖 和葡萄糖，在碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸与还原糖发生氧化-还原反应，生产 3-氨基-5-硝 基水杨酸。其产生物在煮沸条件下 ，其颜色深浅与还原糖含量成正比，可用分光光度法测定。 根据吸光度计算其酶活力。 酶活单位的定义：每 1mL 粗酶液，在一定温度和 pH 值条件下，1min 水解纤维素产生 1μg 还原糖为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 3  仪器和设备 3.1 分析天平：精度为 0.0001g。 3.2 紫外分光光度计。 3.3 恒温水浴锅：精度±0.2℃。 3.4 PH 计：精度为 0.01PH 单位。 4  试剂和溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1 柠檬酸缓冲液（pH=5.0） 磷酸氢二钠溶液（0.2mol/L）：称取 7.16g 磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中，定容至 100ml。 柠檬酸溶液（0.1mol/L）：称取 2.1g 柠檬酸溶解于蒸馏水中，定容至 100ml。 取上述配制的磷酸氢二钠溶液 24.3ml、柠檬酸溶液 25.7ml 混匀即为柠檬酸缓冲液，其 pH 值为 5.0。 4.2 羧甲基纤维素溶液（CMC 溶液） 称取 2.0g 羧甲基纤维素钠盐溶于 200ml 水中，于沸水浴中加热至溶解，过滤，取滤液 100ml，加柠檬酸缓冲液 20ml，蒸馏水 40ml，混匀，储存于 4℃条件下备用。 4.3 3,5-二硝基水杨酸显色液（DNS 试剂） 称取 3,5-二硝基水杨酸 6.3g 加入到约 600ml 水中，逐渐加入氢氧化钠 20.8g，在 50℃的水 浴中加热搅拌溶解后，再依次加入酒石酸钾钠 182g，苯酚 5g 和无水亚硫酸钠 5g，待全部溶解并 RS/TN/ZL-004 分光光度法测定纤维素酶酶活 版号/修改：A/0 共 4 页 第 2 页 澄清后，冷却至室温，用水定容至 1000ml，过滤。滤液储存于棕色瓶中暗处放置 7 天后使用。 4.4 标准葡萄糖溶液（1mg/mL） 准确称取 105℃烘干至恒重的无水葡萄糖 250.000 毫克，溶于蒸馏水中，定溶至 250ml。 5  分析步骤 5.1 标准曲线的绘制 5.1.1 葡萄糖标准溶液：按表 1 配置。 表 1 编 号 葡萄糖标准溶液的浓度 （mg/mL） 取 1mg/mL 葡萄糖标 准溶液的体积 mL 取水的体积 mL 吸光值 Abs. 0 0 0 2.5 1 0.04 2 0 2 0.08 4 0 3 0.12 6 0 4 0.16 8 0 5 0.20 10 0 分别吸取 1mg/ml 标准葡萄糖溶液（4.4）2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，用水分别定溶至 50ml。再分别吸取上述溶液各 10.0ml 于试管中，各加 DNS 试剂 10ml，混匀后于沸水中煮 5min，（另作一个对照，取 10.0ml 蒸馏水加 10mlDNS 试剂，同样煮 5min），冷却后，用分光光度 计于 530nm 波长处测吸光值（比色皿 10mm*10mm），以吸光度为纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含 糖的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 5.2 样品测定 5.2.1 待测酶液的制备 液体酶样：准确吸取样品 10.0ml 于 100ml 容量瓶中，用适宜溶剂（蒸馏水或者缓冲溶液） 定容至刻度。控制稀释样品酶活力在 100u/ml—1000 u/ml 范围内。 固体酶样：准确称取样品 4.0g，精确至 0.0002g。用适量适宜溶剂（蒸馏水或者缓冲溶液） 溶解后，定容至 100ml。再将定容溶液用定性滤纸过滤后，准确吸取 10.0ml，用相应溶剂定容至 100ml。控制稀释样品酶活力在 100u/ml—1000 u/ml 范围内。 5.2.2 测定 按下列程序操作： 试管 A（空白） 加 CMC 溶液 8.00 mL  试管 B（酶试样，需作三个平行试样） 加 CMC 溶液 8.00 mL ↓ ↓ 50±0.2℃保温，3min 50±0.2℃保温，3min RS/TN/ZL-004 分光光度法测定纤维素酶酶活 版号/修改：A/0 共 4 页 第 3 页 ↓ ↓ 加 DNS 试剂 10.00 mL（摇匀） 加酶液 2.00mL（摇匀） ↓ ↓ 50±0.2℃保温，30min（精确计时） 50±0.2℃保温，30min（精确计时） ↓ ↓ 加酶液 2.00mL（摇匀） 加 DNS 试剂 10.00 mL（摇匀） ↓