酶学第五章酶分离纯化与制剂.pptVIP

主讲教师：赵丹丹 第五章 酶的分离纯化与制剂 三、浓 缩 3. 常用的浓缩方法 (4) 反复冻融 (freeze-thawing) 溶液相对纯水，会发生融点升高、冰点降低的现象。 主要方式：先将溶液冻成冰块，然后使之缓缓溶解，这样，几乎不含蛋白质和酶的冰块将浮于液面，而酶等则融解并集中于下层溶液(至原体积的四分之一左右) 主要问题：浓缩过程可能会发生离子强度与pH的变化，从而导致酶失效。反复冻融实际上最好与超声波破碎或酶解一起使用，否则冻融后黏度很大，蛋白质容易聚集，通常都是反复冻融后超声波处理，效果较好。 四、生物材料的选择 来源: 动物, 植物和微生物及其代谢产物 选择材料的要求 (1) 从工业生产角度，来源丰富, 含量较高, 制备工艺简单, 生产成本较低，不能同时具备时抓住主要矛盾决定取舍； (2) 从科研工作的角度，只须符合实验预定的目标要求; (3) 植物材料要注意季节性、地理位置和生长环境等; (4) 动物材料时要注意年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等; (5) 微生物材料要注意菌种的代数和培养基成分等。 材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，如暂不提取，应冰冻保存。 第三节 酶的纯化原理与方法 主要内容：根据溶解度不同、分子大小不同、 电学解离性质、专一亲和作用等。 一、纯化工作前的准备 明确抽提液中的杂质成分 目的酶 + 小分子杂质 + 大分子杂质 (1) 小分子杂质一般会自然地除去，比较容易解决 (2) 大分子杂质包括核酸、粘多糖和杂蛋白 核酸可加硫酸链酶素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白使之沉淀移去，必要时也可使用核酸酶; 粘多糖则常用醋酸铅、乙醇、丹宁酸和离子型表面活性剂等处理解决，有时也可用酶； 杂蛋白的去除是纯化的主要工作，也是比较困难的工作 一、纯化工作前的准备 为了获得较理想的分离效果的注意问题 (1) 工作前全面了解所要纯化的酶的理化性质 在水和各种有机溶剂中的溶解性; 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性; 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性; 各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等; 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性; 对其他生物分子的特殊亲和力等。 这样，就可以知道应选择哪些方法与条件，而应避免哪些处理、 以及在什么情况下酶比杂蛋白更稳定而能加以利用。 一、纯化工作前的准备 为了获得较理想的分离效果的注意问题 (2) 判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活 力测定为准则。 一个好的步骤应该是比活力（纯度）提高大、总活力回收高，而且重现性好; 一般地说，纯化过程中不宜重复相同的步骤和条件，因为这样只能使酶的总活力下降，而不能使酶的纯度进一步上升。 一、纯化工作前的准备 为了获得较理想的分离效果的注意问题 (3) 要严格控制操作条件。 可保证高的重复率; 可防止酶的变性失效，特别是随着酶逐渐纯净、杂蛋白逐渐移除、溶液中的蛋白浓度逐渐下降，蛋白质间的相互保护作用随之减小，酶的稳定性也因之降低，这一点尤为重要。 一、纯化工作前的准备 纯化方法 (1) 依据：酶与杂蛋白在理化性质、稳定性上的差异; 酶的生物特性 (2) 现有方法： 根据溶解度的不同，有盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法及选择性沉淀法等。 根据分子大小的差别，有胶过滤(层析)法、超过滤法及超离心法等。 根据电学、解离性质，有吸附(层析)法、离子交换层析法、电泳法以及集层析与电泳之长的聚焦层析法等。 基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用特点而建立的各种亲和分离法等。 利用稳定性差异而建立的选择性热变性法、酸碱变性法和表面变性法 这些方法中往往同时有两种或多种因素在起作用 二、根据溶解度不同进行纯化 盐析法 有机溶剂沉淀法 共沉淀法 选择性沉淀法 等电点沉淀法 液-液分离法 萃取分离法 沉淀分离法： 改变某些条件或添加某种物质，使酶在溶液中的溶解度较低， 从溶液中析出。 * 盐析法 (1) 原理：酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别 (2) 常用盐：硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠等 (3) 公式? 不同的盐对某种蛋白质具有不同的盐析常数； 同一种盐对不同种蛋白质有不同的盐析常数。 分段盐析：Ks; β (4) 影响因素 (5) 饱和硫酸铵 补 萃取分离法 (1) 萃取是利用系统中组分在溶剂中有不同的溶解度来分离混合物的单元操作，利用相似相溶原理。 (2) 两相