重组子导入与筛选精美生物医学.pptVIP

重组子导入、表达与筛选;找找看……;一、重组DNA分子导入宿主细胞;基因重组;1原核细胞的转化（细菌转化）;宿主细胞  原核细胞：大肠杆菌 真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞 ;;（1）CaCl2转化：;;;[原理] 利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。;3）转化率： DNA分子转化宿主细胞获得转化子的效率 什么叫转化子??? 导入外源DNA分子后能稳定存在的宿主细胞 什么叫重组子？ 导入的外源DNA为重组DNA的转化子 ;;影响因素： 重组DNA： 分子量小，转化率高； 亲和性强的质粒载体转化率高； ccc质粒DNA载体转化率高 受体细胞 转化方法： 电击法转化率最高；氯化钙法次之;（1）农杆菌转化法;基因枪法（gene gun）是依赖高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术。 ;优点：（1）无宿主限制。可以对任何基因型材料进行转化研究；(2)靶受体几乎包括所有具有潜在分化能力的组织或细胞。（3）易于操作。 缺点：如转化频率低、结果的重复性差，易导致基因沉默，实验成本较高等。;3、导入动物细胞;脂质体法;含有目的基因的重组宿主细胞（如细菌）可以通过 规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素）;找找看……;最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。;宿主细胞的选择;二、宿主细胞分为两大类： 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等； 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 ;大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。 ②有各类菌株和载体系列。 ③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。 ④易培养，成本低。;缺点： ①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。 ②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。 ③蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。 ④其内毒素很难除去。 ;酵母 酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。 ;重组子的筛选和鉴定;（一）根据载体的性状变化进行筛选;;  当带有完整抗药性基因的载体转化无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得了抗药性，能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞不能生长。;;;2 根据载体抗药性插入失活选择;根据载体抗药性标志插入失活选择  含有两个以上的抗药基因的载体，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选含重组DNA的菌落，这就是插入失活效应。;;;;外源基因;;β-半乳糖苷酶系统  载体：pUC、pGEM系列载体等 带有一个来自大肠杆菌DNA的短序列，其中含有编码β-半乳糖苷酶（β- galatosidase）基因（LacZ基因）的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框架，不影响功能。; 当这种载体转入的宿主细胞是含有β-半乳糖苷酶C端编码序列时，此酶的N端序列和C端序列可以互补（成为α互补），产生具有酶活性的蛋白质（β-半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有IPTG,X-gal的培养基上呈蓝色。  当多克隆位点有外源DNA片段插入时，破坏此酶的N端阅读框架，产生无α互补功能的N端片段，因此在带有外源DNA片段的细菌在含有IPTG/X-gal的培养基上呈白色。?;LacZ基因;;;;;; 如果外源性DNA片段可编码产生蛋白质，并且该蛋白质为细菌生命活动所必需，可利用该蛋白质的性状进行筛选。 如亮氨酸是细菌生命活动所必需的，当外源性DNA片段含有合成亮氨酸的基因时，将该外源性DNA片段转入亮氨酸缺陷的细菌中，放入仅含亮氨酸的培养基中，只有能利用亮氨酸的细菌才能生长，因此，能生长的细菌即为含有外源性DNA片段。;（二）根据重组DNA的结构特征进行筛选 1、重组DNA的快速裂解、鉴定  初步筛选方法，根据重组DNA大小和载体DNA大小之间的差别来区分的。  琼脂糖凝胶中进行电泳分离，紫