重组子筛选与鉴定.pptVIP

加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 （2）一抗结合 一抗 2.2菌落印迹原位杂交 是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜上，不必进行核酸分离纯化、内切酶酶解及电泳分离等操作，而是经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再与特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出含有插入序列的菌落或噬菌斑。由于生长在培养基平极上的菌落或噬菌斑，是按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，然后在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，所以菌落杂交或噬菌斑杂交隶属原位杂交范畴。以菌落原位杂交为例，操作步骤如下: ①将硝酸纤维素滤膜铺放在生长着转化菌落的平板表面，使其中的质粒DNA转移到滤膜上。 ②作好标记，小心取出滤膜，将吸附菌体的一面朝上放置在预先被强碱溶液浸湿的普通滤纸上进行溶菌和碱变性处理。强碱可以裂解细菌，释放细胞内含物，降解RNA，并使蛋白和DNA变性。 ③将滤膜转移至预先被中性缓冲液浸湿的普通滤纸上，中和NaOH 。 ④将滤膜转移到清洗缓冲液中短暂浸泡，洗去菌体碎片和蛋白质。 ⑤取出滤膜晾干，置于80℃下干燥，使单链DNA牢固地结合在硝酸纤维素滤膜上。 ⑥将滤膜转入探针溶液中，进行杂交反应。 ⑦杂交反应结束后，清洗滤膜，除去未特异性杂交的探针，然后晾干。 ⑧将滤膜与X线片压紧置于暗箱内曝光，由胶片上感光斑点的位置，在原始平板上挑出相应的阳性重组子菌落 特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。 2.3 斑点印迹杂交 如果只要检测克隆菌株、动植物细胞株或转基因个体、器官、组织提取的总DNA或RNA样品中是否含有目的基因，则可采用斑点印迹杂交(dot blotting)或狭线印迹杂交(slot blotting)进行检测，它们是在 Southern印迹杂交的基础上发展的两种相似的快速检测特异核酸(DNA或RNA)分子的核酸杂交技术。 斑点杂交法与菌落原位杂交的原理一样，但方法更简单、迅速，可直接将噬菌体的上清液或是由转化子提取的DNA(RNA)样品直接点在硝酸纤维素滤膜等固体支持物上，与探针进行分子杂交。通过放射自显影，从底片中找出黑点即为阳性斑点。此方法常用于病毒核酸的定量检测。 2.4 Northern blotting Northern 印迹杂交是指将RNA分子变性及电泳分离后，从电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方法，又称为Northern RNA印迹杂交等。 该法是在Southern blotting杂交基础上发展起来的，主要针对RNA分子的检测，基本步骤与Southern印迹杂交相似。但RNA分子与 DNA分子有所不同， 一般不能采用碱变性处理，同时，在RNA电泳时必须解决两个问题：一是防止单链RNA形成高级结构，故必须采用变性凝胶电泳；二是电泳过程中始终要有效抑制RNase的作用，防止RNA分子的降解破坏。 用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。 主要检测插入片断是否被转录。 从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。 第三节 电泳检测法 1直接凝胶电泳检测法 2 切酶酶切片段电泳分析法 3 PCR扩增检测法 利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。 1、直接电泳检测法 从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。出现滞后，称滞后现象 分子量 Marker 载体 重组克隆 2 限制性核改内切酶酶切片段电泳分析法 2.1 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。 或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。 A B A或B 不同克隆的酶切结果 筛选过程 3、PCR扩增检测法 3.1 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 3.2 过程 （1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。 第四节 免疫化学检测法 免疫化学检测法是一种间接的筛选方法，它利用特异性抗体与外源DNA编码的抗原的相互作用进行筛选，特别适用于检测不为宿主提供任何检测标志的基因。 使用该方法的前提是插入的外源基因必须在受体细胞中表达，必须具有目的蛋白质的抗体。 常见的有放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法、wetem印迹分析法等 第四节 免疫化学检测法 1 放射性抗体检测法 2 免疫沉淀检测法 3 酶联免疫吸附测定（ELISA） 4 western印迹分析法 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式： 1. 1 抗体与