下一代测序技术简介.pptVIP

Complete Genomics公司 Complete Genomics公司的DNB阵列生产和cPAL技术的方案示意图。A.待测片段的设计，DNA纳米球的合成，用来放置纳米球规则排列的纳米阵列---这些可以显示DNA纳米球阵列的形成过程； B. 图示：用对应于一个独特接头位点的5个碱基的一组普通探针进行测序过程。图中也显示了标准锚定序列和延伸锚定序列。 此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！ Next Generation Sequencing(NGS) 技术简介 Sanger 测序 Sanger 测序法仍然为基因测序行业内的金标准，但鸟枪测序法在技术上存在瓶颈。（价格昂贵、步骤繁琐、效率低） NGS = Next Generation Sequencing NGS也称为高通量测序High-throughput Sequencing (HTS) 第一代测序：Sanger Sequencing （Sanger测序） 第二代测序： NGS = Massively Parallel Sequencing （大规模平行测序） 第三代测序： NGS = HTS, SingleMolecule Sequencing （高通量、单分子测序） 目前NGS的主要三种测序仪器 三种测序仪在高通量水平、测序准确度、存储格式和技术方法上均有差异。 罗氏/454 基因组测序仪FLX系统 焦磷酸测序法 光学 230-400 在第二代中最高读长；比第一代的测序通量大 样品制备较难；难于处理重复和同种碱基多聚区域；试剂冲洗带来错误累积；仪器昂贵 illumina HiSeq2000/miSeq 可逆链终止物和合成测序法 荧光/光学 2x150 很高测序通量 仪器昂贵；用于数据删节和分析的费用很高 ABI/SOLiD 5500xlSOLiD系统 连接测序法 荧光/光学 25-35 很高测序通量；在广为接受的几种第二代平台中，所要拼接出人类基因组的试剂成本最低 测序运行时间长；读长短，造成成本高，数据分析困难和基因组拼接困难；仪器昂贵 公司 平台名称 测序方法 检测方法 大约读长(碱基数) 优点 相对局限性 三大测序平台的技术特点和差异 Roche 454测序原理 Roche 454焦磷酸测序原理 Roche 454测序步骤 样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。 一、样品处理 Roche 454测序步骤 二、文库制备 文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，454的文库接头分A、B两种，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。 Roche 454测序步骤 三、连接微珠 将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water-in-oil）的稳定乳浊液。在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器（microreactor）中将只包含一个磁珠和一条单链DNA，通过控制条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。 Roche 454测序步骤 四、emRCR PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于后续的步骤。 乳液PCR（emRCR） Roche 454测序步骤 五、反应板准备、上机测序 454测序的反应板称为PTP（Pico Titer Plate），含有350万个由光纤组成的小孔，每个孔的直径为29μm，而测序磁珠的直径为20μm，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。 Roche 454测序步骤 六、测序和分析 将磁珠与测序试剂加入PTP中，使之可用于上机测序。 在454测序仪中，A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的，每步反应四种碱基依次加入反应池，当碱基配对结合，就会释放出一个焦磷酸（PPi），而这个焦磷酸在酶的作用下，将荧光素氧化成氧化荧光素，并发出光信号，从而读取出这一位置的碱基信息。 Illumina测序原理 Illumina合成测序原理 Illumina测序流程 桥式PCR 合成法测序 数据读取 ABI SOLiD测序原理 ABI SOLiD连接测序原理 ABI SOLiD测序流程 制备DNA文库 乳液PCR/微珠富集 连接酶测序:SOLiD连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。这样经过五轮测序反